Inhibición no competitiva

La inhibición no competitiva es un tipo de inhibición enzimática en la que el inhibidor reduce la actividad de la enzima y se une igualmente bien a la enzima, independientemente de que ya se haya unido al sustrato o no. Esto es diferente a la inhibición competitiva, donde la afinidad de unión por el sustrato de la enzima disminuye en presencia de un inhibidor.

El inhibidor puede unirse a la enzima independientemente de que el sustrato ya se haya unido o no, pero si tiene una mayor afinidad por unirse a la enzima en un estado u otro, se llama inhibidor mixto.

Historia

Durante sus años trabajando como médico, Michaelis, un amigo (Peter Rona), construyó un laboratorio compacto en el hospital y, en el transcurso de cinco años, Michaelis logró publicar más de 100 veces. Durante su investigación en el hospital, fue el primero en observar los diferentes tipos de inhibición; utilizando específicamente fructosa y glucosa como inhibidores de la actividad maltasa. La maltasa descompone la maltosa en dos unidades de glucosa. Los hallazgos de ese experimento permitieron la divergencia entre la inhibición competitiva y la no competitiva. La inhibición no competitiva afecta el valor kcat (pero no el K_m) en cualquier gráfico determinado; este inhibidor se une a un sitio que tiene especificidad por una determinada molécula. Michaelis determinó que cuando se une el inhibidor, la enzima se inactiva.

Como muchos otros científicos de su época, Leonor Michaelis y Maud Menten trabajaron en una reacción que se utilizaba para cambiar la composición de la sacarosa y hacer que se lisara en dos productos: fructosa y glucosa. La enzima implicada en esta reacción se llama invertasa, y es la enzima cuya cinética ha sido respaldada por Michaelis y Menten como revolucionaria para la cinética de otras enzimas. Al expresar la velocidad de la reacción estudiada, derivaron una ecuación que describía la velocidad de una manera que sugería que depende principalmente de la concentración de la enzima, así como de la presencia del sustrato, pero solo hasta cierto punto.

Adrian Brown y Victor Henri sentaron las bases para los descubrimientos en cinética enzimática por los que Michaelis y Menten son conocidos. Brown imaginó teóricamente el mecanismo ahora aceptado para la cinética enzimática, pero no tenía los datos cuantitativos para hacer una afirmación. Victor Henri hizo importantes contribuciones a la cinética de enzimas durante su tesis doctoral, sin embargo, no destacó la importancia de la concentración de iones de hidrógeno y la mutarotación de la glucosa. El objetivo de la tesis de Henri era comparar su conocimiento sobre las reacciones catalizadas por enzimas con las leyes reconocidas de la química física. A Henri se le atribuye ser el primero en escribir la ecuación que ahora se conoce como ecuación de Michaelis-Menten. Utilizando glucosa y fructosa en las reacciones catalíticas controladas por la maltasa y la invertasa, Leonor Michaelis fue la primera científica en distinguir los diferentes tipos de inhibición utilizando la escala de pH que no existía en la época de Henri.

Particularmente durante su trabajo para describir la velocidad de esta reacción, también probaron y extrapolaron la idea de otro científico, Victor Henri, de que la enzima que estaban usando tenía cierta afinidad por ambos productos de esta reacción: fructosa y glucosa. Utilizando los métodos de Henri, Michaelis y Menten casi perfeccionaron este concepto de método de tasa inicial para experimentos en estado estacionario. Estaban estudiando la inhibición cuando descubrieron que la inhibición no competitiva (mixta) se caracteriza por su efecto sobre k_cat (tasa de catalizador), mientras que la competitiva se caracteriza por su efecto sobre la velocidad. (V). En los experimentos de Michaelis y Menten se centraron en gran medida en los efectos del pH de la invertasa utilizando iones de hidrógeno. La invertasa es una enzima que se encuentra en la levadura extracelular y cataliza reacciones mediante hidrólisis o inversión de una sacarosa (mezcla de sacarosa y fructosa) para "azúcar invertido". La razón principal para usar la invertasa fue que se podía analizar fácilmente y los experimentos se podían realizar de manera más rápida. La sacarosa gira en polarímetro como dextrógira-D, mientras que el azúcar invertido es levógiro-L. Esto hizo que el seguimiento de la inversión del azúcar fuera relativamente sencillo. También descubrieron que la α-D-glucosa se libera en reacciones catalizadas por la invertasa, que es muy inestable y cambia espontáneamente a β-D-glucosa. Aunque ambos están en forma dextrorrotatoria, aquí es donde notaron que la glucosa puede cambiar espontáneamente, también conocido como mutarotación. No tener esto en cuenta fue una de las principales razones por las que los experimentos de Henri fracasaron. Usando la invertasa para catalizar la inversión de sacarosa, pudieron ver qué tan rápido reaccionaba la enzima mediante polarimetría; por lo tanto, se encontró que se producía inhibición no competitiva en la reacción en la que se invertía sacarosa con invertasa.

Terminología

Es importante tener en cuenta que, si bien todos los inhibidores no competitivos se unen a la enzima en sitios alostéricos (es decir, lugares distintos de su sitio activo), no todos los inhibidores que se unen en sitios alostéricos son inhibidores no competitivos. De hecho, los inhibidores alostéricos pueden actuar como inhibidores competitivos, no competitivos o no competitivos.

Muchas fuentes continúan combinando estos dos términos, o establecen la definición de inhibición alostérica como la definición de inhibición no competitiva.

Mecanismo

La inhibición no competitiva modela un sistema en el que el inhibidor y el sustrato pueden estar unidos a la enzima en cualquier momento dado. Cuando tanto el sustrato como el inhibidor están unidos, el complejo enzima-sustrato-inhibidor no puede formar un producto y sólo puede convertirse nuevamente en el complejo enzima-sustrato o en el complejo enzima-inhibidor. La inhibición no competitiva se distingue de la inhibición mixta general en que el inhibidor tiene igual afinidad por la enzima y el complejo enzima-sustrato.

Por ejemplo, en las reacciones de glucólisis catalizadas por enzimas, la acumulación de fosfoenol es catalizada por la piruvato quinasa en piruvato. La alanina es un aminoácido que se sintetiza a partir de piruvato y también inhibe la enzima piruvato quinasa durante la glucólisis. La alanina es un inhibidor no competitivo, por lo tanto, se une desde el sitio activo al sustrato para que siga siendo el producto final.

Otro ejemplo de inhibición no competitiva lo da la glucosa-6-fosfato que inhibe la hexoquinasa en el cerebro. Los carbonos 2 y 4 de la glucosa-6-fosfato contienen grupos hidroxilo que se unen junto con el fosfato en el carbono 6 al complejo enzima-inhibidor. El sustrato y la enzima son diferentes en las combinaciones de grupos a los que se une un inhibidor. La capacidad de la glucosa-6-fosfato para unirse en diferentes lugares al mismo tiempo la convierte en un inhibidor no competitivo.

El mecanismo más común de inhibición no competitiva implica la unión reversible del inhibidor a un sitio alostérico, pero es posible que el inhibidor funcione a través de otros medios, incluida la unión directa al sitio activo. Se diferencia de la inhibición competitiva en que la unión del inhibidor no impide la unión del sustrato y viceversa, sino que simplemente impide la formación del producto durante un tiempo limitado.

Este tipo de inhibición reduce la velocidad máxima de una reacción química sin cambiar la aparente afinidad de unión del catalizador por el sustrato (K_m^app – ver Michaelis-Menten cinética). Cuando se añade un inhibidor no competitivo, la Vmax cambia, mientras que los Km permanecen sin cambios. Según el gráfico de Lineweaver-Burk, la Vmax se reduce durante la adición de un inhibidor no competitivo, lo que se muestra en el gráfico mediante un cambio tanto en la pendiente como en la intersección con el eje y cuando se agrega un inhibidor no competitivo.

La principal diferencia entre competitivo y no competitivo es que la inhibición competitiva afecta la capacidad del sustrato para unirse al unirse a un inhibidor en lugar de un sustrato, lo que reduce la afinidad de la enzima por el sustrato. En la inhibición no competitiva, el inhibidor se une a un sitio alostérico y evita que el complejo enzima-sustrato realice una reacción química. Esto no afecta la Km (afinidad) de la enzima (por el sustrato). La inhibición no competitiva se diferencia de la inhibición no competitiva en que aún permite que el sustrato se una al complejo enzima-inhibidor y forme un complejo enzima-sustrato-inhibidor; esto no es cierto en la inhibición no competitiva, evita que el sustrato se una a la enzima. inhibidor a través del cambio conformacional tras la unión alostérica.

Ecuación

En presencia de un inhibidor no competitivo, la afinidad enzimática aparente es equivalente a la afinidad real. En términos de cinética de Michaelis-Menten, Kmapp = K_m. Esto puede verse como una consecuencia del principio de Le Chatelier porque el inhibidor se une tanto a la enzima como al complejo enzima-sustrato por igual para mantener el equilibrio. Sin embargo, dado que siempre se inhibe que alguna enzima convierta el sustrato en producto, la concentración de enzima efectiva disminuye.

Matemáticamente,

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Ejemplo: inhibidores no competitivos de la enzima CYP2C9

Los inhibidores no competitivos de la enzima CYP2C9 incluyen nifedipina, tranilcipromina, isotiocianato de fenetilo y 6-hidroxiflavona. La simulación de acoplamiento por computadora y los mutantes construidos sustituidos indican que el sitio de unión no competitivo de la 6-hidroxiflavona es el sitio de unión alostérico informado de la enzima CYP2C9.