Historia de la reacción en cadena de la polimerasa

(Este artículo asume familiaridad con los términos y componentes utilizados en el proceso PCR.)

La historia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha descrito como un clásico momento de inspiración o como un ejemplo de trabajo en equipo entre investigadores dispares. A continuación, se presenta una lista de eventos antes, durante y después de su desarrollo:

• On 25 de abril de 1953 James D. Watson y Francis Crick publicaron "una estructura radicalmente diferente" para el ADN, fundando así el campo de la genética molecular. Su modelo estructural contó con dos hilos de ADN complementario de base, corriendo en direcciones opuestas como doble helix. Concluyeron su informe diciendo que "no ha escapado a nuestro aviso de que el emparejamiento específico que hemos postulado inmediatamente sugiere un posible mecanismo de copia del material genético". Para esta visión se les otorgó el Premio Nobel 1962.
• Comenzando en el mediados de 1950, Arthur Kornberg comenzó a estudiar el mecanismo de replicación de ADN. Por 1957 ha identificado la primera polimerasa de ADN. La enzima era limitada, creando ADN en una sola dirección y requiriendo una imprenta existente para iniciar la copia del hilo de plantilla. En general, el proceso de replicación de ADN es sorprendentemente complejo, requiriendo proteínas separadas para abrir el helix de ADN, mantenerlo abierto, crear cejas, sintetizar el ADN nuevo, eliminar las cartillas, y atar todas las piezas juntas. Kornberg recibió el Premio Nobel 1959.
• En el principios de 1960 H. Gobind Khorana hizo avances significativos en la elucidación del código genético. Posteriormente, inició un gran proyecto para sintetizar totalmente un gen humano funcional. Para lograrlo, Khorana fue pionero en muchas de las técnicas necesarias para hacer y utilizar oligonucleótidos de ADN sintéticos. Los oligonucleótidos específicos de secuencia se utilizaron como bloques de construcción para el gen, y como cartillas y plantillas para la polimerasa de ADN. In 1968 Khorana recibió el Premio Nobel por su trabajo en el Código Genético.
• In 1969 Thomas D. Brock reportó el aislamiento de una nueva especie de bacteria de una fuente caliente en el Parque Nacional Yellowstone. Thermus aquaticus (Taq) se convirtió en una fuente estándar de enzimas capaces de soportar temperaturas más altas que las de E. coli.
• In 1970 Klenow informó una versión modificada de ADN Polymerase I de E. coli. El tratamiento con una proteasa removió la actividad de la nucleasa de esta enzima. La actividad general del fragmento resultante de Klenow es, por tanto, sesgada hacia la síntesis del ADN, en lugar de su degradación.
• Por 1971 Investigadores en el proyecto de Khorana, preocupados por sus rendimientos de ADN, comenzaron a mirar "repair síntesis" – un sistema artificial de imprimaciones y plantillas que permite la polimerasa de ADN copiar segmentos del gen que están sintetizando. Aunque es similar al PCR en el uso de aplicaciones repetidas de polimerasa de ADN, el proceso que suelen describir emplea sólo un complejo de primer-templato único, y por lo tanto no conduciría a la amplificación exponencial vista en PCR.
• Circa 1971 Kjell Kleppe, investigador del laboratorio de Khorana, imaginó un proceso muy similar al PCR. Al final de un documento sobre la técnica anterior, describió cómo un sistema de dos primarias podría llevar a la replicación de un segmento específico de ADN:

uno esperaría obtener dos estructuras, cada una conteniendo la longitud completa del hilo de plantilla adecuadamente complejo con el primer. La polimerasa de ADN se añadirá para completar el proceso de replicación de la reparación. Dos moléculas del dúplex original deben resultar. Todo el ciclo podría repetirse, cada vez se añade una dosis fresca de la enzima.

No se muestran resultados allí, y la mención de experimentos inéditos en otro documento puede (o no puede) referirse al sistema de replicación de dos primarias. (Estos primeros precursores a PCR fueron cuidadosamente analizados en una demanda de patentes, y se discuten en los capítulos de Mullis en La reacción de la cadena de polimerasa (1994).

• También en 1971, Cetus Corporation fue fundada en Berkeley, California, por Ronald Cape, Peter Farley, y Donald Glaser. Inicialmente, la empresa diseñó microorganismos capaces de producir componentes utilizados en la fabricación de alimentos, productos químicos, vacunas o productos farmacéuticos. Después de mudarse a Emeryville, iniciaron proyectos relacionados con la nueva industria biotecnológica, principalmente la clonación y expresión de genes humanos, pero también el desarrollo de pruebas diagnósticas para mutaciones genéticas.
• In 1976 a DNA polimerase was isolated from T. aquaticus. Se encontró que retenía su actividad a temperaturas superiores a 75 °C.
• In 1977 Frederick Sanger reportó un método para determinar la secuencia de ADN. La técnica empleaba una cartilla de oligonucleótido, polimerasa de ADN y precursores de nucleótidos modificados que bloquean una mayor extensión del primer de manera dependiente de secuencias. Por esta innovación fue galardonado con el Premio Nobel 1980.

Para 1980, la comunidad científica ya conocía todos los componentes necesarios para la amplificación por PCR. El uso de la ADN polimerasa para extender cebadores de oligonucleótidos era un procedimiento común en la secuenciación de ADN y la producción de ADNc para clonación y expresión. El uso de la ADN polimerasa para la traducción de mellas era el método más común para marcar sondas de ADN para la transferencia Southern.

• In 1979 Cetus Corporation contrató a Kary Mullis para sintetizar oligonucleótidos para diversos proyectos de investigación y desarrollo en toda la empresa. Estos oligos se utilizaron como sondas para la detección de genes clonados, como cepas para secuenciación de ADN y síntesis de cDNA, y como bloques de construcción de genes. Originalmente sintetizando estos oligos a mano, Mullis posteriormente evaluó prototipos tempranos para sintetizadores automatizados.
• Por Mayo de 1983 Mullis sintetizó sondas oligonucleótido para un proyecto en Cetus para analizar una mutación de anemia falciforme. Escuchando problemas con su trabajo, Mullis propuso una técnica alternativa basada en el método de secuenciación de ADN de Sanger. Realizando la dificultad de hacer el método Sanger específico a una sola ubicación en el genoma, Mullis entonces modificó la idea de añadir una segunda cartilla en el hilo opuesto. Las aplicaciones repetidas de la polimerasa podrían llevar a una reacción en cadena de replicación para un segmento específico del genoma – PCR.
• Más tarde 1983 Mullis comenzó a probar su idea. Su primer experimento no implicaba el ciclismo térmico – esperaba que la polimerasa pudiera realizar la reproducción continua por su cuenta. Los experimentos posteriores de ese año incluyeron ciclos térmicos repetidos, y segmentaron pequeños segmentos de un gen clonado. Mullis consideró estos experimentos un éxito, pero no pudo convencer a otros investigadores.
• In Junio de 1984 Cetus celebró su reunión anual en Monterey, California. Sus científicos y consultores presentaron sus resultados y consideraron proyectos futuros. Mullis presentó un cartel sobre la producción de oligonucleótidos por su laboratorio, y presentó algunos de los resultados de sus experimentos con PCR. Sólo Joshua Lederberg, consultor de Cetus, mostró interés. Más tarde en la reunión, Mullis participó en un altercado físico con otro investigador de Cetus sobre una disputa no relacionada con PCR. El otro científico dejó la compañía, y Mullis fue eliminado como jefe del laboratorio de síntesis de oligo.

• In Septiembre de 1984 Tom White, VP de Investigación en Cetus (y un amigo cercano), presionó a Mullis para tomar su idea al grupo desarrollando el ensayo de mutación genética. Juntos, pasaron los meses siguientes diseñando experimentos que podrían demostrar convincentemente que PCR está trabajando en ADN genómico. Desafortunadamente, el producto de amplificación esperado no era visible en la electroforesis de gel agarose, lo que llevó a confusión en cuanto a si la reacción era específica para la región específica.
• In Noviembre de 1984 los productos de amplificación fueron analizados por la hinchazón del sur, lo que demostró claramente el aumento de las cantidades del producto de ADN de 110 bp esperado. Teniendo la primera señal visible, los investigadores comenzaron a optimizar el proceso. Más tarde, los productos amplificados fueron clonados y secuenciados, mostrando que la mayoría del ADN amplificado era el objetivo deseado, y que el fragmento de Klenow se utilizaba sólo raramente incorporaba nucleótidos incorrectos durante la replicación.

• Tras la práctica industrial normal, Mullis solicitó una patente que cubriera la idea básica de PCR y muchas aplicaciones potenciales, y fue pedido por la PTO para incluir más resultados. On 28 de marzo de 1985, el grupo de desarrollo de Mullis presentó una solicitud centrada en el análisis de la mutación de anemia falciforme a través de PCR y Oligomer restricción. Después de la modificación, ambas patentes fueron aprobadas 28 de julio de 1987.
• En el primavera de 1985 el grupo de desarrollo comenzó a aplicar la técnica PCR a otros objetivos. Las sondas y las sondas fueron diseñadas para un segmento variable del gen DQα del leucocito humano. Esta reacción fue mucho más específica que la del objetivo β-hemoglobina – el producto PCR esperado es directamente visible en la electroforesis de gel agarose. Los productos de amplificación de varias fuentes también fueron clonados y secuenciados, la primera determinación de nuevos alelos por PCR. Al mismo tiempo, la técnica original de ensayo de Restricción Oligomer fue reemplazada por el método más general de oligonucleótido específico Allele.
• También principios de 1985, el grupo comenzó a usar una polimerasa de ADN termostable (la enzima utilizada en la reacción original se destruye en cada paso de calentamiento). En ese momento sólo se habían descrito dos, de Taq y Bst. El informe sobre la polimerasa Taq fue más detallado, por lo que fue elegido para la prueba. La polimerasa Bst fue encontrada más tarde para PCR. Ese verano Mullis intentó aislar la enzima, y un grupo fuera de Cetus fue contratado para hacerlo, todo sin éxito. En el Fallo de 1985 Susanne Stoffel y David Gelfand en Cetus tienen éxito en hacer la polimerasa, y fue inmediatamente encontrado por Randy Saiki para apoyar el proceso PCR.
• Con patentes presentadas, el trabajo procedió a reportar PCR a la comunidad científica general. Un resumen para una reunión de la Sociedad Americana de Genética Humana en Salt Lake City fue presentado en Abril de 1985, y el primer anuncio de PCR fue hecho allí por Saiki en Octubre. Se planearon dos publicaciones: un documento "idea" de Mullis, y un documento de "aplicación" de todo el grupo de desarrollo. Mullis presentó su manuscrito a la revista Nature, que lo rechazó por no incluir resultados. El otro documento, principalmente describiendo el ensayo de análisis OR, fue presentado a Science on 20 de septiembre de 1985, y fue aceptado en noviembre. Después del rechazo del informe de Mullis en diciembre, los detalles sobre el proceso PCR se agregaron rápidamente al segundo documento, que aparece en 20 de diciembre de 1985.
• In Mayo de 1986 Mullis presentó PCR en el Simposio Cold Spring Harbor, y publicó una versión modificada de su manuscrito original 'idea' mucho más tarde. El primer informe no Cetus utilizando PCR fue presentado en 5 de septiembre de 1986, indicando lo rápido que otros laboratorios comenzaron a implementar la técnica. The Cetus development group published their detailed sequence analysis of PCR products on 8 de septiembre de 1986, y su uso de sondas ASO en 13 de noviembre de 1986.
• El uso de la polimerasa Taq en PCR fue anunciado por Henry Erlich en una reunión en Berlín sobre 20 de septiembre de 1986, presentado para su publicación en Octubre de 1987, y fue publicado a principios del próximo año '. La patente para PCR con polimerasa Taq fue presentada en 17 de junio de 1987, y se expidió 23 de octubre de 1990.

En diciembre de 1985, Cetus y Perkin-Elmer establecieron una empresa conjunta para desarrollar instrumentos y reactivos para PCR. Se construyeron termocicladores complejos para realizar las amplificaciones basadas en Klenow, pero nunca se comercializaron. Se desarrollaron máquinas más sencillas para PCR basada en Taq, y el 19 de noviembre de 1987, un comunicado de prensa anunció la disponibilidad comercial del «Termociclador PCR-1000» y la «ADN Polimerasa AmpliTaq». En la primavera de 1985, John Sninsky, de Cetus, comenzó a utilizar la PCR para la difícil tarea de medir la cantidad de VIH circulante en sangre. El 11 de abril de 1986 se anunció una prueba viable, que se publicó en mayo de 1987. De esta manera, se pudo analizar la sangre donada para detectar el virus y monitorizar directamente el efecto de los medicamentos antivirales.En 1985, Norm Arnheim, también miembro del equipo de desarrollo, concluyó su año sabático en Cetus y asumió un puesto académico en la Universidad del Sur de California. Comenzó a investigar el uso de la PCR para amplificar muestras que contenían una sola copia de la secuencia diana. Para 1989, su laboratorio desarrolló la PCR multiplex en espermatozoides individuales para analizar directamente los productos de la recombinación meiótica. Estas amplificaciones de copia única, que se habían realizado por primera vez durante la caracterización de la Taq polimerasa, se volvieron vitales para el estudio del ADN antiguo, así como para la tipificación genética de embriones preimplantados.En 1986, Edward Blake, científico forense del edificio Cetus, colaboró con Henry Erlich, investigador de Cetus, para aplicar la PCR al análisis de pruebas criminales. Se recopiló y codificó un panel de muestras de ADN de casos antiguos, que Saiki analizó a ciegas mediante el ensayo HLA DQα. Al descifrar el código, todas las pruebas y los autores coincidieron. El grupo de Blake y Erlich utilizó la técnica casi de inmediato en el caso Pensilvania contra Pestinikas, el primer uso de la PCR en un caso penal. Esta prueba DQα, desarrollada por Cetus como uno de sus kits "Ampli-Type", se convirtió en parte de los primeros protocolos para el análisis de pruebas forenses, como en el caso del asesinato de O. J. Simpson.En 1989, Alec Jeffreys, quien ya había desarrollado y aplicado las primeras pruebas de huella genética, utilizó la PCR para aumentar su sensibilidad. Con modificaciones posteriores, la amplificación de loci de repetición en tándem de número variable (VNTR) altamente polimórficos se convirtió en el protocolo estándar para las bases de datos nacionales de ADN, como el Sistema de Índice Combinado de ADN (CODIS).En 1987, Russ Higuchi logró amplificar el ADN de un cabello humano. Este trabajo se expandió para desarrollar métodos de amplificación de ADN a partir de muestras altamente degradadas, como ADN antiguo y evidencia forense.

• On 22 de diciembre de 1989, la revista Science otorgó a Taq Polymerase (y PCR) su primera "Molécula del Año". El documento "Taq PCR" se convirtió durante varios años en la publicación más citada en biología.
• Después de la publicación del primer documento de PCR, el Gobierno de los Estados Unidos envió una carta severa a Randy Saiki, avisándole para publicar un informe sobre "reacciones de cadena" sin la revisión y aprobación previa requerida por el Departamento de Energía de los Estados Unidos. Cetus respondió, explicando las diferencias entre PCR y la bomba atómica.
• On 23 de julio de 1991, Cetus anunció que su venta a la vecina empresa biotecnológica Chiron. Como parte de la venta, los derechos a las patentes PCR se vendieron por US$300 millones a Hoffman-La Roche (quien en 1989 había adquirido derechos limitados a PCR). Muchos de los investigadores de Cetus PCR se trasladaron a la filial de Roche, Roche Molecular Systems.
• On 13 de octubre de 1993Kary Mullis, que había dejado Cetus en 1986, fue galardonado con el Premio Nobel de Química. En la mañana de su discurso de aceptación, fue arrestado por autoridades suecas por el "uso inapropiado de un puntero láser".