Hibridación in situ fluorescente

La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) es una técnica citogenética molecular que utiliza sondas fluorescentes que se unen solo a partes concretas de un ácido nucleico. secuencia con un alto grado de complementariedad de secuencia. Fue desarrollado por investigadores biomédicos a principios de los años 1980 para detectar y localizar la presencia o ausencia de secuencias de ADN específicas en los cromosomas. La microscopía de fluorescencia se puede utilizar para determinar dónde está unida la sonda fluorescente a los cromosomas. FISH se utiliza a menudo para encontrar características específicas en el ADN para su uso en asesoramiento genético, medicina e identificación de especies. FISH también se puede utilizar para detectar y localizar objetivos de ARN específicos (ARNm, ARNc y miARN) en células, células tumorales circulantes y muestras de tejido. En este contexto, puede ayudar a definir los patrones espacio-temporales de expresión genética dentro de células y tejidos.

Sondas – ARN y ADN

En biología, una sonda es una hebra única de ADN o ARN que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de interés.

Las sondas de ARN se pueden diseñar para cualquier gen o cualquier secuencia dentro de un gen para la visualización de ARNm, ARNc y miARN en tejidos y células. FISH se utiliza examinando el ciclo de reproducción celular, específicamente la interfase de los núcleos en busca de anomalías cromosómicas. FISH permite el análisis de una gran serie de casos de archivo y es mucho más fácil identificar el cromosoma localizado mediante la creación de una sonda con una base cromosómica artificial que atraerá cromosomas similares. Las señales de hibridación para cada sonda cuando se detecta una anomalía nucleica. Cada sonda para la detección de ARNm y ARNc se compone de aproximadamente 20 a 50 pares de oligonucleótidos, cada par cubre un espacio de 40 a 50 pb. Los detalles dependen de la técnica FISH específica utilizada. Para la detección de miARN, las sondas utilizan química patentada para la detección específica de miARN y cubren toda la secuencia de miARN.

Las sondas a menudo se derivan de fragmentos de ADN que fueron aislados, purificados y amplificados para su uso en el Proyecto Genoma Humano. El tamaño del genoma humano es tan grande, en comparación con la longitud que podría secuenciarse directamente, que fue necesario dividir el genoma en fragmentos. (En el análisis final, estos fragmentos se ordenaron digiriendo una copia de cada fragmento en fragmentos aún más pequeños usando endonucleasas específicas de secuencia, midiendo el tamaño de cada fragmento pequeño usando cromatografía de exclusión por tamaño y usando esa información para determinar dónde se encontraban los fragmentos. fragmentos grandes se superponían entre sí.) Para preservar los fragmentos con sus secuencias de ADN individuales, los fragmentos se agregaron a un sistema de poblaciones de bacterias que se replicaban continuamente. Las poblaciones clonales de bacterias, cada una de las cuales mantiene un único cromosoma artificial, se almacenan en varios laboratorios de todo el mundo. Los cromosomas artificiales (BAC) se pueden cultivar, extraer y etiquetar en cualquier laboratorio que contenga una biblioteca. Las bibliotecas genómicas suelen recibir el nombre de la institución en la que se desarrollaron. Un ejemplo es la biblioteca RPCI-11, que lleva el nombre del Roswell Park Comprehensive Cancer Center (anteriormente conocido como Roswell Park Cancer Institute) en Buffalo, Nueva York. Estos fragmentos son del orden de 100 mil pares de bases y son la base de la mayoría de las sondas FISH.

Proceso de preparación e hibridación – ARN

El propósito de utilizar RNA FISH es detectar transcripciones de ARNm objetivo en células, secciones de tejido o incluso montajes completos. El proceso se realiza en 3 procedimientos principales: preparación del tejido (prehibridación), hibridación y lavado (posthibridación).

La preparación del tejido comienza con la recolección de las secciones de tejido apropiadas para realizar RNA FISH. En primer lugar, se fijan células, células tumorales circulantes (CTC), secciones de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) o congeladas. Algunos fijadores comúnmente utilizados son formaldehído al 4% o paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). FISH también se ha realizado con éxito en células no fijadas. Después de la fijación, las muestras se permeabilizan para permitir la penetración de los reactivos de hibridación. El uso de detergentes en una concentración del 0,1% se utiliza comúnmente para mejorar la permeabilidad del tejido, como Tween-20 o Triton X-100.

Es fundamental que el proceso de hibridación tenga todas las condiciones óptimas para obtener un resultado in situ exitoso, incluida la temperatura, el pH, la concentración de sal y el tiempo de la reacción de hibridación. Después de comprobar todas las condiciones necesarias, se pueden iniciar los pasos de hibridación añadiendo primero una sonda específica de la diana, compuesta por 20 pares de oligonucleótidos, que se hibrida con los ARN diana. Los sistemas de amplificación de señales separados pero compatibles permiten el ensayo multiplex (hasta dos objetivos por ensayo). La amplificación de la señal se logra mediante una serie de pasos de hibridación secuenciales.

Después de los pasos de hibridación, se realizan pasos de lavado. Estos pasos tienen como objetivo eliminar los híbridos no específicos y deshacerse de las moléculas sonda no unidas de las muestras para reducir cualquier señalización de fondo. El uso de lavados con etanol se utiliza normalmente en esta etapa para reducir la autofluorescencia en tejidos o células. Al final del ensayo, las muestras de tejido se visualizan bajo un microscopio de fluorescencia como el microscopio de fluorescencia confocal y el microscopio Keyence.

Proceso de preparación e hibridación – ADN

Primero, se construye una sonda. La sonda debe ser lo suficientemente grande como para hibridar específicamente con su objetivo, pero no tan grande como para impedir el proceso de hibridación. La sonda se marca directamente con fluoróforos, con dianas para anticuerpos o con biotina. El etiquetado se puede realizar de varias formas, como la traducción de mellas o la reacción en cadena de la polimerasa utilizando nucleótidos etiquetados.

Luego se produce una preparación de cromosoma interfase o metafase. Los cromosomas están firmemente unidos a un sustrato, generalmente vidrio. Las secuencias de ADN repetitivas deben ser bloqueadas agregando fragmentos cortos de ADN a la muestra. La sonda se aplica entonces al ADN cromosoma y se incuba durante aproximadamente 12 horas mientras se hibrida. Varios pasos de lavado eliminan todas las sondas no hisbridas o parcialmente híbridas. Los resultados se visualizan y cuantifican utilizando un microscopio capaz de excitar las imágenes de tinte y grabación.

Si la señal fluorescente es débil, puede ser necesaria una amplificación de la señal para superar el umbral de detección del microscopio. La intensidad de la señal fluorescente depende de muchos factores, como la eficiencia del etiquetado de la sonda, el tipo de sonda y el tipo de tinte. Los anticuerpos marcados con fluorescencia o estreptavidina están unidos a la molécula de tinte. Estos componentes secundarios se seleccionan para que tengan una señal fuerte.

Variaciones en sondas y análisis

FISH es una técnica muy general. Las diferencias entre las distintas técnicas FISH suelen deberse a variaciones en la secuencia y el etiquetado de las sondas; y cómo se utilizan en combinación. Las sondas se dividen en dos categorías genéricas: celulares y acelulares. En fluorescente "in situ" La hibridación se refiere a la colocación celular de la sonda.

El tamaño de la sonda es importante porque las sondas más cortas se hibridan de manera menos específica que las sondas más largas, por lo que a menudo se utilizan hebras de ADN o ARN suficientemente largas (a menudo de 10 a 25 nucleótidos) que son complementarias a una secuencia objetivo determinada para localizar un objetivo. La superposición define la resolución de las características detectables. Por ejemplo, si el objetivo de un experimento es detectar el punto de interrupción de una translocación, entonces la superposición de las sondas (el grado en que una secuencia de ADN está contenida en las sondas adyacentes) define la ventana mínima en la que se puede detectar el punto de interrupción. .

La combinación de secuencias de sonda determina el tipo de característica que la sonda puede detectar. Las sondas que se hibridan a lo largo de un cromosoma completo se utilizan para contar el número de un determinado cromosoma, mostrar translocaciones o identificar fragmentos extracromosómicos de cromatina. Esto a menudo se denomina "pintura de cromosomas completos". Si se utilizan todas las sondas posibles, cada cromosoma (el genoma completo) estaría marcado con fluorescencia, lo que no sería particularmente útil para determinar características de secuencias individuales. Sin embargo, es posible crear una mezcla de sondas más pequeñas que sean específicas de una región (locus) particular del ADN; estas mezclas se utilizan para detectar mutaciones por deleción. Cuando se combina con un color específico, se utiliza una mezcla de sondas específicas de locus para detectar translocaciones muy específicas. A menudo se utilizan mezclas especiales de sondas específicas de locus para contar cromosomas, uniéndose a las regiones centroméricas de los cromosomas, que son lo suficientemente distintivas como para identificar cada cromosoma (con la excepción del cromosoma 13, 14, 21, 22).

Una variedad de otras técnicas utilizan mezclas de sondas de diferentes colores. Se puede detectar una variedad de colores en mezclas de tintes fluorescentes, por lo que cada cromosoma humano puede identificarse mediante un color característico utilizando mezclas de sondas de cromosomas completos y una variedad de proporciones de colores. Aunque hay más cromosomas que colores de tintes fluorescentes fácilmente distinguibles, se pueden utilizar proporciones de mezclas de sondas para crear colores secundarios. De manera similar a la hibridación genómica comparativa, la mezcla de sondas para los colores secundarios se crea mezclando la proporción correcta de dos conjuntos de sondas de diferentes colores para el mismo cromosoma. Esta técnica a veces se denomina M-FISH.

La misma física que hace posible una variedad de colores para M-FISH se puede utilizar para la detección de translocaciones. Es decir, los colores que están adyacentes parecen superponerse; se observa un color secundario. Algunos ensayos están diseñados para que el color secundario esté presente o ausente en casos de interés. Un ejemplo es la detección de translocaciones BCR/ABL, donde el color secundario indica enfermedad. Esta variación se llama a menudo FISH de doblefusión o D-FISH. En la situación opuesta, donde la ausencia del color secundario es patológica, se ilustra por un ensayo utilizado para investigar las translocaciones donde sólo uno de los puntos de ruptura es conocido o constante. Las sondas de locus específicas están hechas para un lado del punto de ruptura y el otro cromosoma intacto. En las células normales, se observa el color secundario, pero sólo se observan los colores primarios cuando se produce la translocación. Esta técnica se llama a veces "FISH innovador".

PESCADO de ARN de una sola molécula

RNA FISH de molécula única, también conocido como Stellaris® RNA FISH o smFISH, es un método para detectar y cuantificar ARNm y otras moléculas largas de ARN en una capa delgada de muestra de tejido. Se pueden obtener imágenes de los objetivos de forma fiable mediante la aplicación de múltiples sondas oligonucleotídicas cortas marcadas individualmente. La unión de hasta 48 oligos marcados con fluorescencia a una sola molécula de ARNm proporciona suficiente fluorescencia para detectar y localizar con precisión cada ARNm objetivo en una imagen de microscopía fluorescente de campo amplio. Las sondas que no se unen a la secuencia deseada no logran suficiente fluorescencia localizada para distinguirlas del fondo.

Los ensayos FISH de ARN de una sola molécula se pueden realizar en modo simple o múltiple, y se pueden utilizar como experimento de seguimiento de la PCR cuantitativa, o se pueden obtener imágenes simultáneamente con un ensayo de anticuerpos fluorescentes. La tecnología tiene aplicaciones potenciales en el diagnóstico del cáncer, la neurociencia, el análisis de la expresión genética y el diagnóstico complementario.

PESCADO de fibra

En una técnica alternativa a las preparaciones en interfase o metafase, la fibra FISH, los cromosomas en interfase se unen a un portaobjetos de tal manera que se estiran en línea recta, en lugar de estar enrollados firmemente, como en el FISH convencional, o adoptar una conformación del territorio cromosómico, como en la interfase FISH. Esto se logra aplicando un corte mecánico a lo largo del portaobjetos, ya sea a las células que se han fijado al portaobjetos y luego se han lisado, o a una solución de ADN purificado. Para este fin se utiliza cada vez más una técnica conocida como combinación de cromosomas. La conformación extendida de los cromosomas permite una resolución dramáticamente mayor, incluso de unos pocos kilobases. La preparación de muestras de fibra de PESCADO, aunque conceptualmente simple, es un arte bastante especializado y sólo laboratorios especializados utilizan la técnica de forma rutinaria.

Q-PESCADO

Q-FISH combina FISH con PNA y software informático para cuantificar la intensidad de la fluorescencia. Esta técnica se utiliza habitualmente en la investigación de la longitud de los telómeros.

Flujo-PESCADO

Flow-FISH utiliza citometría de flujo para realizar FISH automáticamente mediante mediciones de fluorescencia por célula.

MA-PESCADO

FISH asistido por microfluidos (MA-FISH) utiliza un flujo de microfluidos para aumentar la eficiencia de la hibridación del ADN, disminuir el costoso consumo de sondas FISH y reducir el tiempo de hibridación. MA-FISH se aplica para detectar el gen HER2 en tejidos de cáncer de mama.

MAR-PESC

La microautorradiografía FISH es una técnica para combinar sustratos radiomarcados con FISH convencional para detectar grupos filogenéticos y actividades metabólicas simultáneamente.

Híbrido Fusion-FISH

Hybrid Fusion FISH (HF-FISH) utiliza una combinación de excitación/emisión aditiva primaria de fluoróforos para generar espectros adicionales a través de un proceso de etiquetado conocido como transmisión óptica dinámica (DOT). Tres fluoróforos primarios son capaces de generar un total de 7 espectros de emisión fácilmente detectables como resultado del marcaje combinatorio mediante DOT. Hybrid Fusion FISH permite aplicaciones FISH altamente multiplexadas dirigidas a paneles de oncología clínica. La tecnología ofrece una puntuación más rápida con conjuntos de sondas eficientes que pueden detectarse fácilmente con microscopios fluorescentes tradicionales.

MERFEZ

La hibridación in situ con fluorescencia resistente a errores multiplexados es una versión altamente multiplexada de smFISH. Utiliza etiquetado combinatorio, seguido de imágenes y luego codificación resistente a errores para capturar una gran cantidad de moléculas de ARN y localización espacial dentro de la célula. La captura de una gran cantidad de moléculas de ARN permite dilucidar las redes reguladoras de genes, predecir la función de genes no anotados e identificar patrones de distribución de moléculas de ARN, que se correlacionan con sus proteínas asociadas.

ESTRELLA DE MAR

Starfish es un conjunto de herramientas de software desarrollado en 2019 por un consorcio de científicos para analizar datos de nueve variaciones diferentes de FISH, ya que todas las variaciones producen el mismo conjunto de datos: valores de expresión genética asignados a las coordenadas xey en una celda. . El software, creado para todos los científicos, no sólo para los bioinformáticos, lee un conjunto de imágenes, elimina el ruido e identifica moléculas de ARN. Este enfoque se ha propuesto definir un esquema de análisis estándar de conjuntos de datos FISH de manera similar al análisis transcriptómico unicelular.

Aplicaciones médicas

A menudo, los padres de niños con una discapacidad del desarrollo quieren saber más sobre las condiciones de su hijo antes de decidir tener otro hijo. Estas preocupaciones pueden abordarse mediante el análisis de la experiencia de los padres. y el ADN del niño. En los casos en los que no se comprende la discapacidad del desarrollo del niño, su causa puede determinarse mediante FISH y técnicas citogenéticas. Ejemplos de enfermedades que se diagnostican mediante FISH incluyen el síndrome de Prader-Willi, el síndrome de Angelman, el síndrome de deleción 22q13, la leucemia mielógena crónica, la leucemia linfoblástica aguda, Cri-du-chat, el síndrome velocardiofacial y el síndrome de Down. La FISH en células espermáticas está indicada para hombres con un cariotipo somático o meiótico anormal, así como para aquellos con oligozoospermia, ya que aproximadamente el 50% de los hombres oligozoospérmicos tienen una mayor tasa de anomalías cromosómicas espermáticas. El análisis de los cromosomas 21, X e Y es suficiente para identificar individuos oligozoospérmicos en riesgo.

En medicina, FISH se puede utilizar para formular un diagnóstico, evaluar el pronóstico o evaluar la remisión de una enfermedad, como el cáncer. Luego el tratamiento se puede adaptar específicamente. Un examen tradicional que implica un análisis de cromosomas en metafase a menudo no puede identificar las características que distinguen una enfermedad de otra, debido a características cromosómicas sutiles; FISH puede dilucidar estas diferencias. FISH también se puede utilizar para detectar células enfermas más fácilmente que los métodos citogenéticos estándar, que requieren la división de células y requieren una preparación manual y un análisis de los portaobjetos por parte de un tecnólogo que requiere mucho tiempo y trabajo. FISH, por el contrario, no requiere células vivas y se puede cuantificar automáticamente: un ordenador cuenta los puntos fluorescentes presentes. Sin embargo, se requiere un tecnólogo capacitado para distinguir diferencias sutiles en los patrones de bandas en los cromosomas metafásicos doblados y torcidos. FISH se puede incorporar al dispositivo de microfluidos Lab-on-a-chip. Esta tecnología aún se encuentra en una etapa de desarrollo pero, al igual que otros métodos de laboratorio en un chip, puede conducir a técnicas de diagnóstico más portátiles.

Identificación de especies

FISH ha sido ampliamente estudiado como técnica de diagnóstico para la identificación de patógenos en el campo de la microbiología médica. Aunque se ha demostrado que es una técnica útil y aplicable, todavía no se aplica ampliamente en los laboratorios de diagnóstico. El corto tiempo hasta el diagnóstico (menos de 2 horas) ha sido una gran ventaja en comparación con la diferenciación bioquímica, pero esta ventaja se ve desafiada por MALDI-TOF-MS, que permite la identificación de una gama más amplia de patógenos en comparación con las técnicas de diferenciación bioquímica. El uso de FISH con fines de diagnóstico ha encontrado su propósito cuando se necesita la identificación inmediata de especies, específicamente para la investigación de hemocultivos para los cuales FISH es una técnica fácil y barata para un diagnóstico preliminar rápido.

FISH también se puede utilizar para comparar los genomas de dos especies biológicas y deducir relaciones evolutivas. Una técnica de hibridación similar se llama zoo blot. Las sondas FISH bacterianas suelen ser cebadores para la región de ARNr 16s.

FISH es ampliamente utilizado en el campo de la ecología microbiana, para identificar microorganismos. Por ejemplo, los biofilms se componen de organizaciones bacterianas complejas (a menudo) de múltiples especies. Preparar sondas de ADN para una especie y realizar FISH con esta sonda permite visualizar la distribución de esta especie específica dentro del biofilm. Preparar sondas (en dos colores diferentes) para dos especies permite a los investigadores visualizar/estudio la co-localización de estas dos especies en el biofilm y puede ser útil para determinar la arquitectura fina del biofilm.

Hibridación genómica comparada

La hibridación genómica comparativa se puede describir como un método que utiliza FISH de manera paralela a la comparación de la fuerza de hibridación para recordar cualquier alteración importante en el proceso de duplicación de las secuencias de ADN en el genoma del núcleo.

Cariotipo virtual

El cariotipo virtual es otra alternativa rentable y clínicamente disponible a los paneles FISH que utiliza de miles a millones de sondas en una sola matriz para detectar cambios en el número de copias, en todo el genoma, con una resolución sin precedentes. Actualmente, este tipo de análisis solo detectará ganancias y pérdidas de material cromosómico y no detectará reordenamientos equilibrados, como translocaciones e inversiones, que son aberraciones características que se observan en muchos tipos de leucemia y linfoma.

Cariotipo espectral

El cariotipo espectral es una imagen de cromosomas coloreados. El cariotipo espectral implica que FISH utilice múltiples formas de muchos tipos de sondas con el resultado de ver cada cromosoma etiquetado a través de su etapa de metafase. Este tipo de cariotipo se utiliza específicamente cuando se buscan disposiciones cromosómicas.

Evolución cromosómica

FISH se puede utilizar para estudiar la evolución de los cromosomas. Las especies relacionadas tienen cromosomas similares. Esta homología puede ser detectada por secuenciación de genes o genomas, pero también por FISH. Por ejemplo, los cromosomas humanos y chimpancés son muy similares y FISH puede demostrar que dos cromosomas chimpancé fusionados para resultar en un cromosoma humano. Del mismo modo, las especies que están más distantes, tienen cromosomas similares pero con cromosomas de distancia creciente tienden a romper y fusionarse y así resultan en cromosomas de mosaico. Esto puede ser demostrado impresionantemente por FISH (ver figura).

Galería

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  Otro esquema del proceso FISH.
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  chip microfluídico que bajó el costo por prueba de FISH en un 90%.
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  Doble etiqueta Imagen FISH; Bifidobacteria Cy3, Total bacteria FITC.
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  Parapeckles visualizados por FISH monomolécula contra NEAT1 (Quasar 570) en células OS U-2 (DAPI).