Hibridación in situ

hibridación in situ (ISH) es un tipo de hibridación que utiliza una cadena de ADN, ARN o ácidos nucleicos modificados complementarios marcados (es decir, una sonda) para localizar una Secuencia de ADN o ARN en una porción o sección de tejido (in situ) o si el tejido es lo suficientemente pequeño (p. ej., semillas de plantas, embriones de Drosophila), en todo el tejido (ISH del montaje completo), en células y en células tumorales circulantes (CTC). Esto es distinto de la inmunohistoquímica, que normalmente localiza proteínas en secciones de tejido.

La hibridación in situ se utiliza para revelar la ubicación de secuencias de ácido nucleico específicas en cromosomas o tejidos, un paso crucial para comprender la organización, regulación y función de los genes. Las técnicas clave actualmente en uso incluyen la hibridación in situ con ARNm con oligonucleótidos y sondas de ARN (tanto radiomarcadas como marcadas con hapteno), análisis con microscopios ópticos y electrónicos, montaje completo in situ hibridación, doble detección de ARN y ARN más proteína, e hibridación fluorescente in situ para detectar secuencias cromosómicas. El ADN ISH se puede utilizar para determinar la estructura de los cromosomas. La ISH de ADN fluorescente (FISH) se puede utilizar, por ejemplo, en diagnóstico médico para evaluar la integridad cromosómica. La RNA ISH (hibridación de ARN in situ) se utiliza para medir y localizar ARN (ARNm, ARNlnc y miARN) dentro de secciones de tejido, células, montajes completos y células tumorales circulantes (CTC). La hibridación in situ fue inventada por los biólogos estadounidenses Mary-Lou Pardue y Joseph G. Gall.

Desafíos de la hibridación in situ

La hibridación in situ es una técnica poderosa para identificar especies de ARNm específicas dentro de células individuales en secciones de tejido, lo que proporciona información sobre los procesos fisiológicos y la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, la hibridación in situ requiere que se sigan muchos pasos con una optimización precisa para cada tejido examinado y para cada sonda utilizada. Para preservar el ARNm diana dentro de los tejidos, a menudo se requiere el uso de fijadores reticulantes (como el formaldehído).

Además, la hibridación in situ en secciones de tejido requiere que los cortes de tejido sean muy finos, normalmente de 3 µm a 7 µm de espesor. Los métodos comunes para preparar secciones de tejido para el procesamiento de hibridación in situ incluyen cortar muestras con un criostato o un cortador de tejido Compresstome. Un criostato toma tejido fresco o fijado y lo sumerge en nitrógeno líquido para congelarlo instantáneamente. Luego, el tejido se incluye en un medio congelado llamado OCT y se cortan secciones delgadas. Los obstáculos incluyen la aparición de artefactos de congelación en el tejido que pueden interferir con la tinción adecuada del ARNm. El Compresstome corta el tejido en rodajas finas sin necesidad de congelarlo; Las secciones que flotan libremente se cortan después de incrustarse en agarosa para mayor estabilidad. Este método evita la congelación del tejido y, por tanto, los artefactos de congelación asociados. El proceso es permanente e irreversible una vez que se completa.

Proceso

Para la histoquímica de hibridación, las células y tejidos de muestra generalmente se tratan para fijar las transcripciones objetivo en su lugar y aumentar el acceso de la sonda. Como se señaló anteriormente, la sonda es un ADN complementario marcado o, ahora más comúnmente, un ARN complementario (ribosonda). La sonda se hibrida con la secuencia diana a temperatura elevada y luego el exceso de sonda se elimina por lavado (después de una hidrólisis previa usando RNasa en el caso de una sonda de ARN en exceso sin hibridar). Los parámetros de la solución, como la temperatura, la sal y/o la concentración de detergente, se pueden manipular para eliminar cualquier interacción no idéntica (es decir, solo permanecerán unidas las coincidencias de secuencia exacta). Luego, la sonda que se marcó con bases marcadas con radio, fluorescencia o antígeno (p. ej., digoxigenina) se localiza y cuantifica en el tejido mediante autorradiografía, microscopía de fluorescencia o inmunohistoquímica, respectivamente. ISH también puede usar dos o más sondas, marcadas con radiactividad u otros marcadores no radiactivos, para detectar simultáneamente dos o más transcritos.

Se puede utilizar una tecnología alternativa, el ensayo de ADN ramificado, para ensayos de hibridación in situ de ARN (ARNm, ARNc y miARN) con sensibilidad de una sola molécula sin el uso de radiactividad. Este enfoque (p. ej., ensayos ViewRNA) se puede utilizar para visualizar hasta cuatro objetivos en un ensayo y utiliza un diseño de sonda patentado y amplificación de señal de ADNb para generar señales sensibles y específicas. Las muestras (células, tejidos y CTC) se fijan y luego se tratan para permitir la accesibilidad del objetivo de ARN (desenmascaramiento de ARN). Las sondas específicas de la diana se hibridan con cada ARN diana. La amplificación de la señal posterior se basa en la hibridación específica de sondas adyacentes (oligonucleótidos [oligos] individuales que se unen uno al lado del otro en objetivos de ARN). Una sonda específica de objetivo típica contendrá 40 oligonucleótidos, lo que dará como resultado 20 pares de oligo que se unen uno al lado del otro en el objetivo para la detección de ARNm y ARNc, y 2 oligos o un solo par para la detección de miARN. La amplificación de la señal se logra mediante una serie de pasos de hibridación secuenciales. Una molécula preamplificadora se hibrida con cada par de oligos en el ARN específico del objetivo, luego múltiples moléculas amplificadoras se hibridan con cada preamplificador. A continuación, múltiples oligonucleótidos sonda marcadores (conjugados con fosfatasa alcalina o directamente con fluoróforos) se hibridan con cada molécula amplificadora. Una estructura de amplificación de señales “árbol” completamente ensamblada tiene 400 sitios de unión para las sondas marcadoras. Cuando todas las sondas específicas de la diana se unen al transcrito de ARNm diana, se produce una amplificación de la señal de 8.000 veces para ese transcrito. Los sistemas de amplificación de señales separados pero compatibles permiten los ensayos multiplex. La señal se puede visualizar utilizando un microscopio de fluorescencia o de campo claro.

Pasos básicos para sondas marcadas con digoxigenina

1. permeabilización de células con proteinasa K para abrir membranas celulares (alrededor de 25 minutos, no necesarias para secciones de tejido o algunos embriones en estadio temprano)
2. unión de mRNAs a la sonda RNA marcada (normalmente durante la noche)
3. anticuerpo-fosfatasa vinculante para el RNA-probe (algunas horas)
4. mancha de anticuerpo (por ejemplo, con fosfatasa alcalina)

El protocolo tarda entre 2 y 3 días y su configuración requiere algo de tiempo. Algunas empresas venden robots para automatizar el proceso (por ejemplo, CEM InsituPro). Como resultado, se han realizado exámenes a gran escala en laboratorios de miles de genes. Por lo general, se puede acceder a los resultados a través de sitios web (ver enlaces externos).