Hibridación ADN-ADN

En genómica, la hibridación ADN-ADN es una técnica de biología molecular que mide el grado de similitud genética entre grupos de secuencias de ADN. Por lo general, se usa para determinar la distancia genética entre dos organismos y se ha usado ampliamente en filogenia y taxonomía.

Método

El ADN de un organismo se marca y luego se mezcla con el ADN no marcado para compararlo. La mezcla se incuba para permitir que las cadenas de ADN se disocien y luego se enfría para formar ADN de doble cadena híbrido renovado. Las secuencias hibridadas con un alto grado de similitud se unirán más firmemente y requerirán más energía para separarlas: es decir, se separan cuando se calientan a una temperatura más alta que las secuencias diferentes, un proceso conocido como "fusión de ADN".

Para evaluar el perfil de fusión del ADN hibridado, el ADN de doble cadena se une a una columna o filtro y la mezcla se calienta en pequeños pasos. En cada paso, se lava la columna o el filtro; las secuencias que se derriten se vuelven monocatenarias y se lavan. Las temperaturas a las que se desprende el ADN marcado reflejan la cantidad de similitud entre las secuencias (y la muestra de autohibridación sirve como control). Estos resultados se combinan para determinar el grado de similitud genética entre organismos.

Se introdujo un método para hibridar un gran número de muestras de ADN con un gran número de sondas de ADN en una sola membrana. Estas muestras tendrían que separarse en sus propios carriles dentro de las membranas y luego la membrana tendría que girarse a un ángulo diferente donde daría como resultado una hibridación simultánea con muchas sondas de ADN diferentes.

Usos

Cuando se comparan varias especies, los valores de similitud permiten ordenar los organismos en un árbol filogenético; por lo tanto, es un enfoque posible para llevar a cabo la sistemática molecular.

En microbiología

La hibridación ADN-ADN (DDH) se utiliza como método principal para distinguir las especies bacterianas, ya que es difícil clasificarlas visualmente con precisión. Esta técnica no se usa mucho en organismos más grandes donde las diferencias en las especies son más fáciles de identificar. A finales de 1900, se consideraba que las cepas pertenecían a la misma especie si tenían un valor de similitud ADN-ADN superior al 70 % y sus temperaturas de fusión estaban dentro de los 5 °C entre sí. En 2014, se sugirió un umbral del 79 % de similitud para separar las subespecies bacterianas.

DDH es una técnica común para las bacterias, pero es laboriosa, propensa a errores y técnicamente desafiante. En 2004 se describió una nueva técnica DDH. Esta técnica utilizó microplacas y ADN marcado colorimétricamente para disminuir el tiempo necesario y aumentar la cantidad de muestras que se pueden procesar. Esta nueva técnica DDH se convirtió en el estándar para la taxonomía bacteriana.

En zoología

Charles Sibley y Jon Ahlquist, pioneros de la técnica, utilizaron la hibridación ADN-ADN para examinar las relaciones filogenéticas de las aves (la taxonomía Sibley-Ahlquist) y los primates.

En radiactividad

En 1969, Mary Lou Pardue y Joseph G. Gall realizaron uno de estos métodos en la Universidad de Yale a través de la radiactividad, donde involucraba la hibridación de un ADN de prueba radiactivo en solución con el ADN estacionario de una preparación citológica, que se identifica como autorradiografía.

Reemplazo por secuenciación del genoma

Los críticos argumentan que la técnica es inexacta para la comparación de especies estrechamente relacionadas, ya que cualquier intento de medir las diferencias entre secuencias ortólogas entre organismos se ve abrumado por la hibridación de secuencias parálogas dentro del genoma de un organismo. La secuenciación de ADN y las comparaciones computacionales de secuencias ahora son generalmente el método para determinar la distancia genética, aunque la técnica todavía se usa en microbiología para ayudar a identificar bacterias.

Métodos in silico

El enfoque moderno consiste en llevar a cabo la hibridación ADN-ADN in silico utilizando genomas total o parcialmente secuenciados. El GGDC y TYGS desarrollados en DSMZ son las herramientas conocidas más precisas para calcular valores análogos a DDH. Entre otras mejoras algorítmicas, resuelve el problema de las secuencias parálogas filtrándolas cuidadosamente de las coincidencias entre las dos secuencias del genoma. El método se ha utilizado para resolver taxones difíciles como Escherichia coli, el grupo Bacillus cereus y Aeromonas.