Hemocitómetro

El hemocitómetro (o hemocitómetro) es un dispositivo de cámara de recuento diseñado originalmente y utilizado habitualmente para contar células sanguíneas.

El hemocitómetro fue inventado por Louis-Charles Malassez y consiste en un portaobjetos de vidrio grueso para microscopio con una hendidura rectangular que crea una cámara de volumen de precisión. Esta cámara está grabada con una cuadrícula de líneas perpendiculares grabada con láser. El dispositivo está cuidadosamente diseñado para que se conozca el área delimitada por las líneas y también la profundidad de la cámara. Por lo tanto, observando un área definida de la rejilla, es posible contar el número de células o partículas en un volumen específico de fluido y calcular así la concentración de células en el fluido en general. Un tipo de hemocitómetro muy utilizado es la cámara de recuento Neubauer.

Se utilizan otros tipos de hemocitómetros con diferentes regulaciones para diferentes aplicaciones. Reglas de Fuchs-Rosenthal, comúnmente utilizadas para el recuento de líquido cefalorraquídeo, reglas de Howard Mould utilizadas para el moho en alimentos y productos de embalaje de alimentos, reglas de McMaster Egg Slide utilizadas para contar huevos microbianos en materia fecal, reglas de la Cámara de Nageotte para contar niveles bajos de glóbulos blancos en leucocitos. componentes plaquetarios reducidos en células, regla Palmer Nanoplancton para contar plancters más pequeños. El contador Petroff-Hausser que utiliza reglas de Neubauer mejoradas se utiliza para recuentos de bacterias o espermatozoides y se ofrece con diferentes profundidades de cámara. La regla de células de Sedgwick-Rafter en un hemocitómetro está diseñada principalmente para su uso en la microscopía del agua potable.

Principios

El área cuadriculada del hemocitómetro reglado de Neubauer mejorado consta de nueve cuadrados de 1 x 1 mm (1 mm²). Estos se subdividen en tres direcciones; 0,25 x 0,25 mm (0,0625 mm²), 0,25 x 0,20 mm (0,05 mm²) y 0,20 x 0,20 mm (0,04 mm²). El cuadrado central se subdivide en cuadrados de 0,05 x 0,05 mm (0,0025 mm²). Los bordes elevados del hemocitómetro mantienen el cubreobjetos a 0,1 mm de la cuadrícula marcada, dando a cada cuadrado un volumen definido (consulte la figura de la derecha).

Uso

Para utilizar el hemocitómetro, primero asegúrese de que el cubreobjetos especial proporcionado con la cámara de recuento esté colocado correctamente en la superficie de la cámara de recuento. Cuando las dos superficies de vidrio están en contacto adecuado, se pueden observar los anillos de Newton. Si es así, la suspensión celular se aplica al borde del cubreobjetos para ser succionada hacia el vacío por acción capilar que llena completamente la cámara con la muestra. El número de células en la cámara se puede determinar mediante conteo directo usando un microscopio, y las células visualmente distinguibles se pueden contar diferencialmente. El número de células en la cámara se utiliza para calcular la concentración o densidad de las células en la mezcla de la que proviene la muestra. Es el número de células de la cámara dividido por el volumen de la cámara, que se conoce desde el principio teniendo en cuenta las posibles diluciones y los atajos de conteo:

${mbox {mbox{concentration of cells in original mix}}}=left({frac {mbox{number of cells counted}}{mbox{proportion of chamber counted})({mbox{volume of original squares counted})}right)left({mbox{volume {mbox{volume original de dilumbox}$

${displaystyle {mbox{cells/mL}}=left({frac {mbox{number of cells counted}})({mbox{dilution factor}}} {mbox{mbox{number of large squares counted}}}}}right)times 10000}$

donde el volumen de la muestra diluida (después de la dilución) dividido por el volumen de la mezcla original en la muestra (antes de la dilución) es el factor de dilución. Por ejemplo, si el volumen de la mezcla original era de 20 μL y se diluyó una vez (agregando 20 μL de diluyente), entonces el segundo término entre paréntesis es 40 μL/20 μL. El volumen de los cuadrados contados es el que se muestra en la tabla superior, dependiendo del tamaño (ver figura de la derecha). El número de células contadas es la suma de todas las células contadas en los cuadrados de una cámara. La proporción de celdas contadas se aplica si no se cuentan todos los cuadrados internos dentro de un cuadrado (es decir, si solo se cuentan 4 de las 20 en un cuadrado de esquina, entonces este término será igual a 0,2). Al contar cuadrados grandes con un volumen de 100 nanolitros (nL), una multiplicación por 10.000 conduce al recuento de células por mililitro deseado.

Para la mayoría de las aplicaciones, sólo se utilizan los cuatro cuadrados de esquina grandes. Las celdas que están en las líneas superior e izquierda o las tocan, se cuentan, pero las que están en las líneas derecha o inferior o las tocan, se ignoran.

Requisitos

La suspensión original debe mezclarse bien antes de tomar una muestra. Esto garantiza que la muestra sea representativa y no solo un artefacto de la región particular de la mezcla original de la que se extrajo.

Se debe utilizar una dilución adecuada de la mezcla con respecto al número de células a contar. Si la muestra no se diluye lo suficiente, las células estarán demasiado abarrotadas y será difícil contarlas. Si está demasiado diluida, el tamaño de la muestra no será suficiente para hacer inferencias sólidas sobre la concentración en la mezcla original.

Al realizar una prueba redundante en una segunda cámara, se pueden comparar los resultados. Si difieren más de 2 veces el error de conteo (raíz cuadrada del conteo), el método de toma de la muestra puede no ser confiable (por ejemplo, la mezcla original no está bien mezclada).

La cámara de recuento debe llenarse por acción capilar después de colocar la tapa de la cámara (cubreobjetos especial con espesor y planitud certificados). Esto evita el riesgo de que las células se sedimenten o se peguen al vidrio o que se evapore algo de volumen antes de colocar el cubreobjetos encima y que se produzca una sobreestimación de la concentración de células. La sedimentación es un problema menor con las bacterias, pero la evaporación, más frecuente en laboratorios con aire acondicionado de baja humedad, aún debe minimizarse.

Aplicaciones

• Conteo de sangre: para pacientes con glóbulos sanguíneos anormales, donde los contadores automatizados no funcionan bien.
• Sperm cuenta
• Microscopia de orina
• Cultura celular: cuando se somete o graba el crecimiento celular con el tiempo.
• Cerveza de cerveza: para la preparación de la levadura.
• Phytoplankton celular contando
• Procesamiento celular para el análisis de aguas abajo: se necesitan números de células exactas en muchas pruebas (PCR, quitometría de flujo), mientras que algunos otros requieren alta viabilidad celular.
• Medición del tamaño de la célula: en un micrografo, el tamaño real de la célula se puede inferir al escalar a la anchura de un cuadrado hemocitométrico, que se conoce.