Helicasa

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Las helicasas son una clase de enzimas que se cree que son vitales para todos los organismos. Su función principal es descomprimir el material genético de un organismo. Las helicasas son proteínas motoras que se mueven direccionalmente a lo largo de un esqueleto de fosfodiéster de ácido nucleico, separando dos hebras de ácido nucleico hibridadas (por lo tanto, helic-+-asa), usando energía de la hidrólisis de ATP. Hay muchas helicasas, que representan la gran variedad de procesos en los que debe catalizarse la separación de cadenas. Aproximadamente el 1% de los genes eucariotas codifican helicasas.

El genoma humano codifica 95 helicasas no redundantes: 64 helicasas de ARN y 31 helicasas de ADN. Muchos procesos celulares, como la replicación del ADN, la transcripción, la traducción, la recombinación, la reparación del ADN y la biogénesis de los ribosomas implican la separación de cadenas de ácido nucleico que requiere el uso de helicasas. Algunas helicasas especializadas también participan en la detección de ácidos nucleicos virales durante la infección y cumplen una función inmunológica.

Función

Las helicasas se utilizan a menudo para separar hebras de una doble hélice de ADN o una molécula de ARN auto-recolectada utilizando la energía de la hidrólisis de ATP, un proceso caracterizado por la ruptura de los enlaces de hidrógeno entre las bases de nucleótidos recocidas. También funcionan para eliminar proteínas asociadas a ácidos nucleicos y catalizar la recombinación de ADN homólogo. Las helicasas facilitan los procesos metabólicos del ARN, como la traducción, la transcripción, la biogénesis de los ribosomas, el empalme del ARN, el transporte del ARN, la edición del ARN y la degradación del ARN. Las helicasas se mueven incrementalmente a lo largo de una hebra de ácido nucleico del dúplex con una direccionalidad y procesividad específicas para cada enzima en particular.

Las helicasas adoptan diferentes estructuras y estados de oligomerización. Mientras que las helicasas tipo DnaB desenrollan el ADN como hexámeros en forma de anillo, se ha demostrado que otras enzimas son activas como monómeros o dímeros. Los estudios han demostrado que las helicasas pueden actuar de forma pasiva, esperando que se produzca el desenrollado no catalizado y luego translocándose entre hebras desplazadas, o pueden desempeñar un papel activo en la catalización de la separación de hebras utilizando la energía generada en la hidrólisis de ATP. En este último caso, la helicasa actúa de manera similar a un motor activo, desenrollándose y translocándose a lo largo de su sustrato como resultado directo de su actividad ATPasa. Las helicasas pueden procesar mucho más rápido in vivo que in vitrodebido a la presencia de proteínas accesorias que ayudan en la desestabilización de la unión en horquilla.

La helicasa (triángulo azul) separa las hebras de ADN entrelazadas para que se puedan formar las hebras hijas.La helicasa (triángulo azul) separa las hebras de ADN entrelazadas para que se puedan formar las hebras hijas.

Barrera de activación en actividad helicasa

La acción de la helicasa enzimática, como el desenrollado de los ácidos nucleicos, se logra mediante la disminución de la barrera de activación (B) de cada acción específica. La barrera de activación es el resultado de varios factores y se puede definir mediante la siguiente ecuación, donde

norte= número de pares de bases desenrollados (bps),

{displaystyleDelta G_{bp}}= energía libre de formación de pares de bases,

{displaystyle G_{int}}= reducción de la energía libre debido a la helicasa, y

G_{f}= reducción de la energía libre debido a las fuerzas de descompresión.{displaystyle B=N(Delta G_{bp}-G_{int}-G_{f})}

Los factores que contribuyen a la altura de la barrera de activación incluyen: la secuencia de ácido nucleico específica de la molécula involucrada, el número de pares de bases involucrados, la tensión presente en la horquilla de replicación y las fuerzas de desestabilización.

Helicasas activas y pasivas

El tamaño de la barrera de activación a superar por la helicasa contribuye a su clasificación como helicasa activa o pasiva. En las helicasas pasivas existe una importante barrera de activación (definida como k_{B}T}">, donde k_{{B}}es la constante de Boltzmann y Tes la temperatura del sistema). Debido a esta importante barrera de activación, su progresión de desenrollamiento se ve afectada en gran medida por la secuencia de ácidos nucleicos dentro de la molécula a desenrollar y la presencia de fuerzas de desestabilización que actúan sobre la horquilla de replicación. Ciertas combinaciones de ácidos nucleicos disminuirán las tasas de desenrollado (es decir, guanina y citosina), mientras que varias fuerzas desestabilizadoras pueden aumentar la tasa de desenrollado. En los sistemas pasivos, la tasa de desenrollado ({displaystyle V_{un}}) es menor que la tasa de translocación ({displaystyle V_{trans}}) (translocación a lo largo del ácido nucleico monocatenario, ssNA). Otra forma de ver la helicasa pasiva es su confianza en el desenredado transitorio de los pares de bases en la horquilla de replicación para determinar su tasa de desenrollado.

En las helicasas activas <img src="https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/2d3307c6f31a5b8f153442dd19c0cf3f27acbeb8" alt="{displaystyle B, donde el sistema carece de una barrera importante, ya que la helicasa es capaz de desestabilizar los ácidos nucleicos, desenrollando la doble hélice a una velocidad constante, independientemente de la secuencia del ácido nucleico. En helicasas activas, {displaystyle V_{un}}es aproximadamente igual a {displaystyle V_{trans}}. Otra forma de ver la helicasa activa es su capacidad para desestabilizar directamente la horquilla de replicación para promover el desenrollado.

Las helicasas activas muestran un comportamiento similar cuando actúan sobre ambos ácidos nucleicos de doble cadena, dsNA o ssNA, con respecto a las tasas de desenrollado y las tasas de translocación, donde en ambos sistemas {displaystyle V_{un}}y {displaystyle V_{trans}}son aproximadamente iguales.

Estas dos categorías de helicasas también pueden modelarse como mecanismos. En tales modelos, las helicasas pasivas se conceptualizan como trinquetes brownianos, impulsadas por fluctuaciones térmicas y gradientes anisotrópicos posteriores a lo largo de la red de ADN. Las helicasas activas, por el contrario, se conceptualizan como motores paso a paso, también conocidos como motores de carrera de potencia, que utilizan un "gusano de pulgada" conformacional o un mecanismo de "caminar" de mano sobre mano para progresar. Dependiendo del organismo, tal progreso de desplazamiento helicoidal puede ocurrir a velocidades de rotación en el rango de 5000 a 10 000 RPM.

Historia de las ADN helicasas

Las helicasas de ADN se descubrieron en E. coli en 1976. Esta helicasa se describió como una "enzima desenrolladora de ADN" que "desnaturaliza los dúplex de ADN en una reacción dependiente de ATP, sin degradarse de manera detectable". La primera helicasa de ADN eucariota descubierta fue en 1978 en la planta de lirio. Desde entonces, se han descubierto y aislado ADN helicasas en otras bacterias, virus, levaduras, moscas y eucariotas superiores. Hasta la fecha, se han aislado al menos 14 helicasas diferentes de organismos unicelulares, 6 helicasas de bacteriófagos, 12 de virus, 15 de levadura, 8 de plantas, 11 de timo de ternera y aproximadamente 25 helicasas de células humanas. A continuación se muestra una historia del descubrimiento de la helicasa:

Características estructurales

La función común de las helicasas explica el hecho de que muestren cierto grado de homología de secuencia de aminoácidos; todos poseen motivos de secuencia ubicados en el interior de su estructura primaria, involucrados en la unión de ATP, la hidrólisis de ATP y la translocación a lo largo del sustrato de ácido nucleico. La porción variable de la secuencia de aminoácidos está relacionada con las características específicas de cada helicasa.

La presencia de estos motivos de helicasa permite atribuir una supuesta actividad de helicasa a una proteína determinada, pero no la confirma necesariamente como una helicasa activa. Sin embargo, los motivos conservados respaldan una homología evolutiva entre las enzimas. Sobre la base de estos motivos de helicasa, se han distinguido varias superfamilias de helicasas.

Superfamilias

Las helicasas se clasifican en 6 grupos (superfamilias) según sus motivos de secuencia compartidos. Las helicasas que no forman una estructura de anillo se encuentran en las superfamilias 1 y 2, y las helicasas que forman un anillo forman parte de las superfamilias 3 a 6. Las helicasas también se clasifican como α o β dependiendo de si funcionan con ADN de cadena simple o doble; Las helicasas α funcionan con ADN monocatenario y las helicasas β funcionan con ADN bicatenario. También se clasifican por polaridad de translocación. Si la translocación ocurre 3'-5', la helicasa es de tipo A; si la translocación ocurre 5'-3' es de tipo B.

Todas las helicasas son miembros de una familia que contiene el motivo P-loop o Walker.

Trastornos y enfermedades de la helicasa

Mutaciones de la helicasa ATRX

El gen ATRX codifica la helicasa dependiente de ATP, ATRX (también conocida como XH2 y XNP) de la familia del subgrupo SNF2, que se cree que es responsable de funciones como la remodelación de la cromatina, la regulación génica y la metilación del ADN. Estas funciones ayudan en la prevención de la apoptosis, lo que resulta en la regulación del tamaño cortical, así como una contribución a la supervivencia de las estructuras corticales y del hipocampo, lo que afecta la memoria y el aprendizaje. Esta helicasa se encuentra en el cromosoma X (Xq13.1-q21.1), en la heterocromatina pericentromérica y se une a la proteína heterocromatina 1. Los estudios han demostrado que ATRX desempeña un papel en la metilación del ADNr y es esencial para el desarrollo embrionario. Se han encontrado mutaciones en todo el ATRXproteína, con más del 90% de ellos ubicados en los dominios de dedo de zinc y helicasa. Las mutaciones de ATRX pueden provocar retraso mental ligado al cromosoma X alfa talasemia (síndrome ATR-X).

Se ha encontrado que varios tipos de mutaciones encontradas en ATRX están asociadas con ATR-X, incluidas las más comunes mutaciones sin sentido de una sola base, así como mutaciones sin sentido, de cambio de marco y de deleción. Las características de ATR-X incluyen: microcefalia, anomalías esqueléticas y faciales, retraso mental, anomalías genitales, convulsiones, uso y capacidad limitados del lenguaje y alfa-talasemia. El fenotipo observado en ATR-X sugiere que la mutación del gen ATRX provoca la regulación a la baja de la expresión génica, como los genes de la globina alfa. Todavía se desconoce qué causa la expresión de las diversas características de ATR-X en diferentes pacientes.

Mutaciones puntuales de la helicasa XPD

XPD (Xeroderma pigmentosum factor D, también conocido como proteína ERCC2) es una helicasa dependiente de ATP 5'-3', Superfamilia II, que contiene dominios de grupos de hierro-azufre. Se ha demostrado que las mutaciones puntuales heredadas en XPD helicasa están asociadas con trastornos de envejecimiento acelerado como el síndrome de Cockayne (CS) y la tricotiodistrofia (TTD). El síndrome de Cockayne y la tricotiodistrofia son trastornos del desarrollo relacionados con la sensibilidad a la luz ultravioleta y el envejecimiento prematuro, y el síndrome de Cockayne presenta un retraso mental grave desde el momento del nacimiento. La mutación de la helicasa XPD también se ha implicado en el xeroderma pigmentoso (XP), un trastorno caracterizado por la sensibilidad a la luz ultravioleta y que provoca un aumento de varias 1000 veces en el desarrollo de cáncer de piel.

XPD es un componente esencial del complejo TFIIH, un factor de transcripción y reparación en la célula. Como parte de este complejo, facilita la reparación por escisión de nucleótidos al desenrollar el ADN. TFIIH ayuda a reparar el ADN dañado, como el daño solar. Una mutación en la helicasa XPD que ayuda a formar este complejo y contribuye a su función provoca la sensibilidad a la luz solar que se observa en las tres enfermedades, así como el aumento del riesgo de cáncer que se observa en XP y el envejecimiento prematuro que se observa en la tricotiodistrofia y el síndrome de Cockayne.

Las mutaciones de la helicasa XPD que conducen a la tricotiodistrofia se encuentran en toda la proteína en varios lugares involucrados en las interacciones proteína-proteína. Esta mutación da como resultado una proteína inestable debido a su incapacidad para formar interacciones estabilizadoras con otras proteínas en los puntos de mutaciones. Esto, a su vez, desestabiliza todo el complejo TFIIH, lo que conduce a defectos en los mecanismos de transcripción y reparación de la célula.

Se ha sugerido que las mutaciones de la helicasa XPD que conducen al síndrome de Cockayne podrían ser el resultado de mutaciones dentro de XPD, lo que provoca rigidez de la proteína y la posterior incapacidad para cambiar de funciones de reparación a funciones de transcripción debido a un "bloqueo" en el modo de reparación. Esto podría hacer que la helicasa corte segmentos de ADN destinados a la transcripción. Aunque la evidencia actual apunta a un defecto en la helicasa XPD que resulta en una pérdida de flexibilidad en la proteína en casos de síndrome de Cockayne, aún no está claro cómo esta estructura de proteína conduce a los síntomas descritos en el síndrome de Cockayne.

En xeroderma pigmentosa, la mutación XPD helicasa existe en el sitio de unión de ATP o ADN. Esto da como resultado una helicasa estructuralmente funcional capaz de facilitar la transcripción, sin embargo, inhibe su función en el desenrollado del ADN y la reparación del ADN. La falta de capacidad de una célula para reparar mutaciones, como las causadas por el daño solar, es la causa de la alta tasa de cáncer en pacientes con xeroderma pigmentosa.

Mutaciones de la familia RecQ

Las helicasas RecQ (3'-5') pertenecen al grupo de helicasas Superfamilia II, que ayudan a mantener la estabilidad del genoma y suprimen la recombinación inapropiada. Las deficiencias y/o mutaciones en las helicasas de la familia RecQ muestran una recombinación genética aberrante y/o una replicación del ADN, lo que provoca inestabilidad cromosómica y una disminución general de la capacidad de proliferación. Se ha demostrado que las mutaciones en las helicasas de la familia RecQ BLM, RECQL4 y WRN, que desempeñan un papel en la regulación de la recombinación homóloga, dan como resultado las enfermedades autosómicas recesivas Síndrome de Bloom (BS), síndrome de Rothmund-Thomson (RTS) y síndrome de Werner (WS).), respectivamente.

El síndrome de Bloom se caracteriza por una predisposición al cáncer de aparición temprana, con una edad media de aparición de 24 años. Los pacientes con síndrome de células de Bloom muestran una alta frecuencia de intercambio recíproco entre cromátidas hermanas (SCE) y daño cromosómico excesivo. Hay evidencia que sugiere que BLM desempeña un papel en el rescate de la replicación del ADN interrumpida en las horquillas de replicación.

El síndrome de Werner es un trastorno de envejecimiento prematuro, con síntomas que incluyen la aparición temprana de aterosclerosis y osteoporosis y otras enfermedades relacionadas con la edad, una alta incidencia de sarcoma y la muerte a menudo por infarto de miocardio o cáncer en la cuarta a sexta década de la vida. Las células de los pacientes con síndrome de Werner exhiben una vida reproductiva reducida con roturas cromosómicas y translocaciones, así como grandes deleciones de componentes cromosómicos, lo que provoca inestabilidad genómica.

El síndrome de Rothmund-Thomson, también conocido como poiquilodermia congénita, se caracteriza por envejecimiento prematuro, anomalías cutáneas y esqueléticas, erupción cutánea, poiquilodermia, cataratas juveniles y predisposición a cánceres como los osteosarcomas. Se encuentran reordenamientos cromosómicos que causan inestabilidad genómica en las células de pacientes con síndrome de Rothmund-Thomson.

Recombinación meiótica

Durante la meiosis, las roturas de doble cadena del ADN y otros daños en el ADN de una cromátida se reparan mediante recombinación homóloga utilizando la cromátida hermana o una cromátida no hermana homóloga como plantilla. Esta reparación puede resultar en un recombinante de cruce (CO) o, más frecuentemente, un recombinante sin cruce (NCO). En la levadura Schizosaccharomyces pombe, la ADN helicasa FmI1 de la familia FANCM dirige la formación de recombinación de NCO durante la meiosis. La helicasa Rqh1 de tipo RecQ también dirige la recombinación meiótica NCO. Estas helicasas, a través de su capacidad para desenrollar los intermedios del bucle D, promueven la recombinación de NCO mediante el proceso de recocido de cadenas dependiente de la síntesis.

En la planta Arabidopsis thaliana, la helicasa FANCM promueve NCO y antagoniza la formación de CO recombinantes. Otra helicasa, RECQ4A/B, también reduce de forma independiente los CO. Se sugirió que los CO están restringidos debido a los costos a largo plazo de la recombinación de CO, es decir, la ruptura de combinaciones genéticas favorables de alelos creadas por la selección natural pasada.

ARN helicasas

Las helicasas de ARN son esenciales para la mayoría de los procesos del metabolismo del ARN, como la biogénesis de los ribosomas, el empalme del pre-ARNm y el inicio de la traducción. También juegan un papel importante en la detección de ARN viral. Las ARN helicasas están involucradas en la mediación de la respuesta inmune antiviral porque pueden identificar ARN extraños en vertebrados. Alrededor del 80% de todos los virus son virus de ARN y contienen sus propias helicasas de ARN. Las helicasas de ARN defectuosas se han relacionado con cánceres, enfermedades infecciosas y trastornos neurodegenerativos. Algunos trastornos neurológicos asociados con ARN helicasas defectuosas son: esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, ataxia espinocerebelosa tipo 2, enfermedad de Alzheimer y síndrome de contractura congénita letal.

Las helicasas de ARN y las helicasas de ADN se pueden encontrar juntas en todas las superfamilias de helicasas excepto en SF6. Todas las ARN helicasas eucariotas que se han identificado hasta la fecha no forman anillos y forman parte de SF1 y SF2. Por otro lado, se han encontrado helicasas de ARN formadoras de anillos en bacterias y virus. Sin embargo, no todas las ARN helicasas presentan actividad helicasa definida por la función enzimática, es decir, proteínas de la familia Swi/Snf. Aunque estas proteínas portan los motivos típicos de helicasa, hidrolizan ATP de una manera dependiente del ácido nucleico y se construyen alrededor de un núcleo de helicasa, en general, no se observa actividad de desenrollado.

Las helicasas de ARN que exhiben actividad de desenrollado se han caracterizado por al menos dos mecanismos diferentes: desenrollado dúplex canónico y separación de cadena local. El desenrollado dúplex canónico es la separación direccional paso a paso de una hebra dúplex, como se describe anteriormente, para el desenrollado del ADN. Sin embargo, la separación local de cadenas se produce mediante un proceso en el que la enzima helicasa se carga en cualquier lugar a lo largo del dúplex. Esto suele contar con la ayuda de una región monocatenaria del ARN, y la carga de la enzima va acompañada de la unión de ATP. Una vez que la helicasa y el ATP se unen, se produce la separación de la hebra local, lo que requiere la unión del ATP pero no el proceso real de hidrólisis del ATP.Presentado con menos pares de bases, el dúplex se disocia sin más ayuda de la enzima. Este modo de desenrollado es utilizado por las helicasas de caja DEAD/DEAH.

Una base de datos de helicasas de ARN está actualmente disponible en línea que contiene una lista completa de helicasas de ARN con información como secuencia, estructura y funciones bioquímicas y celulares.

Herramientas de diagnóstico para la medición de helicasas

Medición y seguimiento de la actividad de la helicasa

Se utilizan varios métodos para medir la actividad helicasa in vitro. Estos métodos van desde ensayos cualitativos (ensayos que generalmente implican resultados que no involucran valores o mediciones) hasta cuantitativos (ensayos con resultados numéricos que pueden utilizarse en análisis estadístico y numérico). En 1982–1983, se desarrolló el primer ensayo bioquímico directo para medir la actividad helicasa. Este método se denominó "ensayo de desplazamiento de cadena".

El ensayo de desplazamiento de hebra es aceptable para el análisis cualitativo, su incapacidad para mostrar resultados para más de un único punto de tiempo, su consumo de tiempo y su dependencia de compuestos radiactivos para el etiquetado justificaron la necesidad de desarrollar diagnósticos que puedan monitorear la actividad de helicasa en tiempo real..

Posteriormente se desarrollaron otros métodos que incorporaron algunos, si no todos, de los siguientes: mecánica de alto rendimiento, el uso de marcaje de nucleótidos no radiactivos, tiempo de reacción más rápido/menos consumo de tiempo, monitoreo en tiempo real de la actividad de la helicasa (usando la medición cinética en lugar de análisis de punto final/punto único). Estas metodologías incluyen: "un método de flujo de enfriamiento rápido, ensayos basados ​​en fluorescencia, ensayos de filtración, un ensayo de proximidad de centelleo, un ensayo de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo, un ensayo basado en tecnología flashplate, ensayos de extinción homogéneos de fluorescencia resuelta en el tiempo y electroquimioluminiscencia -ensayos basados ​​en helicasa".Con el uso de ecuaciones matemáticas especializadas, algunos de estos ensayos se pueden utilizar para determinar cuántos nucleótidos apareados de bases puede romper una helicasa por hidrólisis de 1 molécula de ATP.

También se encuentran disponibles kits de diagnóstico comercialmente disponibles. Uno de estos kits es el ensayo de diagnóstico "Trupoint" de PerkinElmer, Inc. Este ensayo es un ensayo de extinción de fluorescencia de resolución temporal que utiliza la tecnología "SignalClimb" de PerkinEmer que se basa en dos etiquetas que se unen muy cerca una de la otra pero en direcciones opuestas. hebras de ADN Un marcador es un quelato de lantánido fluorescente, que sirve como marcador que se controla a través de un lector de placas de 96/384 pocillos adecuado. La otra etiqueta es una molécula extintora orgánica. La base de este ensayo es la "extinción" o represión de la señal del quelato de lantánidos por parte de la molécula extintora orgánica cuando los dos están muy cerca, como lo estarían cuando el dúplex de ADN está en su estado nativo. Tras la actividad de helicasa en el dúplex, las etiquetas del extintor y del lantánido se separan a medida que se desenrolla el ADN. Esta pérdida de proximidad anula la capacidad de los extintores para reprimir la señal de los lantánidos, lo que provoca un aumento detectable de la fluorescencia que es representativo de la cantidad de ADN desenrollado y puede utilizarse como medida cuantificable de la actividad helicasa. La ejecución y el uso de técnicas de imagen de fluorescencia de una sola molécula, centrándose en métodos que incluyen atrapamiento óptico junto con imagen epifluorescente, y también inmovilización de superficie junto con visualización de fluorescencia de reflexión interna total. En combinación con las células de flujo de microcanales y el control de microfluidos, permite obtener imágenes y rastrear moléculas de ADN y proteínas marcadas con fluorescencia individuales, lo que permite medir el desenrollado y la translocación del ADN con una resolución de molécula única.

Determinación de la polaridad de la helicasa

La polaridad de la helicasa, que también se considera "direccionalidad", se define como la dirección (caracterizada como 5'→3' o 3'→5') del movimiento de la helicasa en la cadena sencilla de ADN/ARN a lo largo de la cual se mueve. Esta determinación de polaridad es vital en f.ex. determinar si la helicasa analizada se une a la cadena principal de ADN o a la cadena rezagada de ADN. Para caracterizar esta característica de helicasa, se usa un ADN parcialmente dúplex como sustrato que tiene una región central de ADN monocatenario con diferentes longitudes de regiones dúplex de ADN (una región corta que corre 5'→3' y una región más larga que corre 3 '→5') a ambos lados de esta región. Una vez que se agrega la helicasa a esa región monocatenaria central, la polaridad se determina mediante caracterización en el ADN monocatenario recién formado.