Glutatión

Glutatión (GSH,) es un antioxidante en plantas, animales, hongos y algunas bacterias y arqueas. El glutatión es capaz de prevenir el daño a importantes componentes celulares causado por fuentes tales como especies reactivas de oxígeno, radicales libres, peróxidos, peróxidos de lípidos y metales pesados. Es un tripéptido con un enlace peptídico gamma entre el grupo carboxilo de la cadena lateral del glutamato y la cisteína. El grupo carboxilo del residuo de cisteína se une mediante enlace peptídico normal a la glicina.

Biosíntesis y ocurrencia

La biosíntesis del glutatión implica dos pasos dependientes del trifosfato de adenosina:

• Primero, γ-glutamylcysteine se sintetiza L-glutamato y cisteína. Esta conversión requiere la enzima glutamato-cisteine ligase (GCL, glutamato cysteine synthase). Esta reacción es el paso límite de velocidad en la síntesis de glutatión.
• En segundo lugar, la glicina se añade al C-terminal de γ-glutamylcysteine. Esta condensación es catalizada por glutatión sintetasa.

Si bien todas las células animales son capaces de sintetizar glutatión, se ha demostrado que la síntesis de glutatión en el hígado es esencial. Los ratones knockout para GCLC mueren al mes de nacer debido a la ausencia de síntesis hepática de GSH.

El inusual enlace gamma amida en el glutatión lo protege de la hidrólisis por peptidasas.

Ocurrencia

El glutatión es el tiol más abundante en las células animales, con un rango de 0,5 a 10 mmol/L. Está presente en el citosol y los orgánulos.

Los seres humanos sintetizan glutatión, pero algunos eucariotas no, incluidos algunos miembros de Fabaceae, Entamoeba y Giardia. Las únicas arqueas conocidas que producen glutatión son las halobacterias. Algunas bacterias, como las "cianobacterias" y Pseudomonadota, pueden biosintetizar glutatión.

Función bioquímica

El glutatión existe en estado reducido (GSH) y oxidado (GSSG). La relación entre el glutatión reducido y el glutatión oxidado dentro de las células es una medida del estrés oxidativo celular, donde el aumento de la relación GSSG a GSH es indicativo de un mayor estrés oxidativo. En células y tejidos sanos, más del 90 % de la reserva total de glutatión se encuentra en forma reducida (GSH), y el resto en forma de disulfuro (GSSG).

En el estado reducido, el grupo tiol del residuo de cisteinilo es una fuente de un equivalente reductor. De este modo se genera disulfuro de glutatión (GSSG). El estado oxidado se convierte al estado reducido por NADPH. Esta conversión es catalizada por la glutatión reductasa:

NADPH + GSSG + H₂O → 2 GSH + NADP⁺ + OH⁻

Funciones

Antioxidante

GSH protege las células al neutralizar (reducir) las especies reactivas de oxígeno. Esta conversión se ilustra mediante la reducción de peróxidos:

2 GSH + R₂O₂ → GSSG + 2 ROH (R = H, alkyl)

y con los radicales libres:

GSH + R^• → 1.2 GSSG + RH

Regulación

Además de desactivar radicales y oxidantes reactivos, el glutatión participa en la protección del tiol y la regulación redox de las proteínas tiol celulares bajo estrés oxidativo mediante la proteína S-glutationilación, una modificación postraduccional del tiol regulada por redox. La reacción general implica la formación de un disulfuro asimétrico a partir de la proteína protegible (RSH) y GSH:

RSH + GSH + [O] → GSSR + H₂O

El glutatión también se emplea para la desintoxicación de metilglioxal y formaldehído, metabolitos tóxicos producidos bajo estrés oxidativo. Esta reacción de desintoxicación se lleva a cabo por el sistema de glioxalasa. La glioxalasa I (EC 4.4.1.5) cataliza la conversión de metilglioxal y glutatión reducido en S-D-lactoilglutatión. La glioxalasa II (EC 3.1.2.6) cataliza la hidrólisis de S-D-lactoilglutatión a glutatión y ácido D-láctico.

Mantiene los antioxidantes exógenos como las vitaminas C y E en sus estados reducidos (activos).

Metabolismo

Entre los muchos procesos metabólicos en los que participa, el glutatión es necesario para la biosíntesis de leucotrienos y prostaglandinas. Desempeña un papel en el almacenamiento de cisteína. El glutatión mejora la función de la citrulina como parte del ciclo del óxido nítrico. Es un cofactor y actúa sobre la glutatión peroxidasa.

Conjugación

El glutatión facilita el metabolismo de los xenobióticos. Las enzimas glutatión S-transferasa catalizan su conjugación con xenobióticos lipofílicos, lo que facilita su excreción o su posterior metabolismo. El proceso de conjugación se ilustra mediante el metabolismo de la imina de N-acetil-p-benzoquinona (NAPQI). NAPQI es un metabolito reactivo formado por la acción del citocromo P450 sobre el paracetamol (acetaminofén). El glutatión se conjuga con NAPQI y el conjunto resultante se excreta.

Posibles neurotransmisores

El glutatión, junto con el glutatión oxidado (GSSG) y el S-nitrosoglutatión (GSNO), se unen al sitio de reconocimiento de glutamato de los receptores NMDA y AMPA (a través de sus fracciones γ-glutamil). GSH y GSSG pueden ser neuromoduladores. En concentraciones milimolares, GSH y GSSG también pueden modular el estado redox del complejo del receptor NMDA. El glutatión se une y activa los receptores ionotrópicos, convirtiéndolo potencialmente en un neurotransmisor.

El GSH activa el receptor purinérgico P2X7 de la glía de Müller, lo que induce señales transitorias agudas de calcio y la liberación de GABA tanto de las neuronas retinianas como de las células gliales.

En plantas

En las plantas, el glutatión está involucrado en el control del estrés. Es un componente del ciclo del glutatión-ascorbato, un sistema que reduce el peróxido de hidrógeno venenoso. Es el precursor de las fitoquelatinas, oligómeros de glutatión que quelan metales pesados como el cadmio. El glutatión es necesario para una defensa eficaz contra patógenos de plantas como Pseudomonas syringae y Phytophthora brassicae. La adenilil-sulfato reductasa, una enzima de la vía de asimilación del azufre, utiliza el glutatión como donante de electrones. Otras enzimas que utilizan glutatión como sustrato son las glutaredoxinas. Estas pequeñas oxidorreductasas están involucradas en el desarrollo de las flores, el ácido salicílico y la señalización de defensa de las plantas.

Biodisponibilidad

La disponibilidad sistémica del glutatión consumido por vía oral es escasa porque el tripéptido es el sustrato de las proteasas (peptidasas) del tubo digestivo y debido a la ausencia de un portador específico de glutatión a nivel celular. membrana.

Determinación de glutatión

Reactivo de Ellman y monobromobimano

El glutatión reducido se puede visualizar utilizando el reactivo de Ellman o derivados bimánicos como el monobromobimánico. El método monobromobimane es más sensible. En este procedimiento, las células se lisan y los tioles se extraen utilizando un tampón HCl. A continuación, los tioles se reducen con ditiotreitol y se marcan con monobromobimano. Monobromobimane se vuelve fluorescente después de unirse a GSH. A continuación, los tioles se separan mediante HPLC y la fluorescencia se cuantifica con un detector de fluorescencia.

Monoclorobimano

Usando monoclorobimano, la cuantificación se realiza mediante microscopía de barrido láser confocal después de la aplicación del tinte a las células vivas. Este proceso de cuantificación se basa en medir las tasas de cambios de fluorescencia y se limita a las células vegetales.

CMFDA también se ha utilizado por error como sonda de glutatión. A diferencia del monoclorobimano, cuya fluorescencia aumenta al reaccionar con el glutatión, el aumento de fluorescencia de CMFDA se debe a la hidrólisis de los grupos acetato en el interior de las células. Aunque CMFDA puede reaccionar con el glutatión en las células, el aumento de la fluorescencia no refleja la reacción. Por lo tanto, los estudios que utilizan CMFDA como sonda de glutatión deben revisarse y reinterpretarse.

Tiol Quant Verde

La principal limitación de estas sondas basadas en bimane y muchas otras sondas informadas es que estas sondas se basan en reacciones químicas irreversibles con el glutatión, lo que hace que estas sondas sean incapaces de monitorear la dinámica del glutatión en tiempo real. Recientemente, se informó sobre la primera sonda fluorescente basada en una reacción reversible, ThiolQuant Green (TQG), para el glutatión. ThiolQuant Green no solo puede realizar mediciones de alta resolución de los niveles de glutatión en células individuales utilizando un microscopio confocal, sino que también se puede aplicar en citometría de flujo para realizar mediciones a granel.

Tiol real

La sonda RealThiol (RT) es una sonda de GSH basada en una reacción reversible de segunda generación. Algunas características clave de RealThiol:

• tiene una kinetica de reacción mucho más rápida y atrasada en comparación con ThiolQuant Green, que permite el monitoreo en tiempo real de la dinámica de GSH en células vivas;
• sólo micromolar a submicromolar RealThiol es necesario para manchar en experimentos basados en células, lo que induce una perturbación mínima al nivel GSH en células;
• se implementó un fluoroforo coumarina de alto rendimiento cuántico para minimizar el ruido de fondo; y
• la constante del equilibrio de la reacción entre RealThiol y GSH ha sido ajustada para responder a la concentración fisiológicamente relevante de GSH.

RealThiol se puede utilizar para realizar mediciones de los niveles de glutatión en células individuales mediante un microscopio confocal de alta resolución, así como también se puede aplicar en citometría de flujo para realizar mediciones a granel con un alto rendimiento.

También se ha desarrollado una sonda de RT dirigida a orgánulos. Se informó y demostró una versión dirigida a las mitocondrias, MitoRT, en el monitoreo de la dinámica del glutatión mitocondrial tanto en el microscopio confocoal como en el análisis basado en FACS.

Sondas de glutatión basadas en proteínas

Otro enfoque, que permite la medición del potencial redox del glutatión a una alta resolución espacial y temporal en células vivas, se basa en imágenes redox utilizando la proteína fluorescente verde sensible a redox (roGFP) o la proteína fluorescente amarilla sensible a redox (rxYFP). Debido a su concentración fisiológica muy baja, GSSG es difícil de medir con precisión. La concentración de GSSG varía de 10 a 50 μM en todos los tejidos sólidos y de 2 a 5 μM en sangre (13-33 nmol/g Hb). La proporción de GSH a GSSG de los extractos de células enteras se estima entre 100 y 700. Esas proporciones representan una mezcla de las reservas de glutatión de diferentes estados redox de diferentes compartimentos subcelulares (p. ej., más oxidado en el RE, más reducido en la matriz mitocondrial), sin embargo. Las proporciones de GSH a GSSG in vivo se pueden medir con precisión subcelular utilizando sensores redox basados en proteínas fluorescentes, que han revelado proporciones de 50 000 a 500 000 en el citosol, lo que implica que la concentración de GSSG se mantiene en el rango de pM.

Usos

Enología

El contenido de glutatión en el mosto, la primera forma cruda del vino, determina el efecto de dorado o caramelizado durante la producción de vino blanco al atrapar las quinonas del ácido cafeoiltartárico generadas por oxidación enzimática como producto de reacción de la uva. Su concentración en el vino se puede determinar mediante espectrometría de masas UPLC-MRM.