Glutatión S-transferasa

Las glutatión S-transferasas (GST), anteriormente conocidas como ligandinas, son una familia de sustancias eucariotas y Isoenzimas metabólicas procarióticas de fase II mejor conocidas por su capacidad para catalizar la conjugación de la forma reducida de glutatión (GSH) a sustratos xenobióticos con el fin de desintoxicar. La familia GST consta de tres superfamilias: las proteínas citosólicas, mitocondriales y microsomales, también conocidas como MAPEG. Los miembros de la superfamilia GST son extremadamente diversos en cuanto a secuencias de aminoácidos, y una gran fracción de las secuencias depositadas en bases de datos públicas tienen una función desconocida. La Enzyme Function Initiative (EFI) está utilizando GST como superfamilia modelo para identificar nuevas funciones de GST.

Los GST pueden constituir hasta un 10% de proteína citosolica en algunos órganos mamíferos. Los GST catalizan la conjugación de GSH, a través de un grupo sulfhydryl, a centros electrofílicos en una amplia variedad de sustratos para que los compuestos sean más solubles en agua. Esta actividad desintoxica compuestos endógenos como los lípidos peróxidos y permite el desglose de los xenobióticos. Los GST también pueden atar toxinas y funcionar como proteínas de transporte, lo que dio lugar a la temprana duración de los GST, ligandin.

Clasificación

La secuencia y estructura de las proteínas son criterios de clasificación adicionales importantes para las tres superfamilias (citosólica, mitocondrial y MAPEG) de GST: mientras que las clases de la superfamilia citosólica de GST poseen más del 40 % de homología de secuencia, las de otras clases pueden tener menos. del 25%. Los GST citosólicos se dividen en 13 clases según su estructura: alfa, beta, delta, épsilon, zeta, theta, mu, nu, pi, sigma, tau, phi y omega. Los GST mitocondriales pertenecen a la clase kappa. La superfamilia MAPEG de GST microsomales consta de subgrupos denominados I-IV, entre los cuales las secuencias de aminoácidos comparten menos del 20% de identidad. Las GST citosólicas humanas pertenecen a las clases alfa, zeta, theta, mu, pi, sigma y omega, mientras que se sabe que existen seis isoenzimas pertenecientes a las clases I, II y IV de la superfamilia MAPEG.

Nomenclatura

La nomenclatura estandarizada GST propuesta por primera vez en 1992 identifica la especie a la que pertenece la isoenzima de interés con una inicial minúscula (p. ej., "h" para humanos), que precede a la abreviatura GST. Posteriormente, la clase de isoenzima se identifica con una letra mayúscula (p. ej., "A" para alfa), seguida de un número arábigo que representa la subfamilia (o subunidad) de la clase. Debido a que tanto las GST mitocondriales como las citosólicas existen como dímeros, y solo se forman heterodímeros entre miembros de la misma clase, el segundo componente de la subfamilia del dímero enzimático se indica con un guión, seguido de un número arábigo adicional. Por lo tanto, si una glutatión S-transferasa humana es un homodímero de la subfamilia 1 de clase pi, su nombre se escribirá como "hGSTP1-1."

La nomenclatura inicial de las GST se refería a ellas como proteínas "Y", en referencia a su separación en la fracción "Y" (a diferencia de las fracciones "X y Z") mediante cromatografía Sephadex G75. A medida que se identificaron las subunidades de GST, se las denominó Ya, Yp, etc. y, si era necesario, un número que identificaba la isoforma del monómero (por ejemplo, Yb1). Litwack et al propusieron el término "ligandina" para cubrir las proteínas anteriormente conocidas como proteínas "Y".

En química clínica y toxicología, los términos alfa GST, mu GST y pi GST se utilizan con mayor frecuencia.

Estructura

El sitio de unión del glutatión, o "sitio G", se encuentra en el dominio similar a la tiorredoxina de las GST tanto citosólicas como mitocondriales. La región que contiene la mayor cantidad de variabilidad entre las diversas clases es la de la hélice α2, donde uno de los tres residuos de aminoácidos diferentes interactúa con el residuo de glicina del glutatión. Se han caracterizado dos subgrupos de GST citosólicos en función de su interacción con el glutatión: el grupo Y-GST, que utiliza un residuo de tirosina para activar el glutatión, y el S/C-GST, que utiliza residuos de serina o cisteína.

"Las proteínas GST son proteínas globulares con una N-terminal helical mixto y dominio beta-strand y un todo-hogar C- dominio final."

La enzima porcina de clase pi pGTSP1-1 fue la primera GST cuya estructura se determinó y es representativa de otros miembros de la superfamilia GST citosólica, que contiene un dominio N-terminal similar a la tiorredoxina, así como un dominio C -dominio terminal formado por hélices alfa.

Las GST citosólicas de mamíferos son diméricas y ambas subunidades pertenecen a la misma clase de GST, aunque no necesariamente idénticas. Los monómeros tienen un tamaño de aproximadamente 25 kDa. Están activos sobre una amplia variedad de sustratos con una superposición considerable. La siguiente tabla enumera todas las enzimas GST de cada clase que se sabe que existen en el Homo sapiens, tal como se encuentra en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot.

Evolución

El desafío ambiental por toxinas naturales ayudó a preparar a Drosophilae para el desafío del DDT, al dar forma a la evolución de Drosophila GST - que metaboliza ambos.

Función

La actividad de las GST depende de un suministro constante de GSH de las enzimas sintéticas gamma-glutamilcisteína sintetasa y glutatión sintetasa, así como de la acción de transportadores específicos para eliminar los conjugados de GSH de la célula. La función principal de los GST es desintoxicar los xenobióticos catalizando el ataque nucleofílico del GSH sobre los átomos electrófilos de carbono, azufre o nitrógeno de dichos sustratos xenobióticos no polares, evitando así su interacción con proteínas celulares y ácidos nucleicos cruciales. Específicamente, la función de las GST en esta función es doble: unirse tanto al sustrato en el sitio hidrofóbico H de la enzima como al GSH en el sitio G hidrofílico adyacente, que juntos forman el sitio activo de la enzima; y posteriormente activar el grupo tiol del GSH, permitiendo el ataque nucleofílico al sustrato. La molécula de glutatión se une en una hendidura entre los dominios N y C-terminal; se propone que los residuos catalíticamente importantes residan en el N-terminal. dominio. Ambas subunidades del dímero GST, ya sean de naturaleza hetero u homodimérica, contienen un único sitio de unión sin sustrato, así como un sitio de unión a GSH. Sin embargo, en los complejos heterodiméricos de GST, como los formados por las clases citosólicas mu y alfa, la hendidura entre las dos subunidades alberga un sitio de unión xenobiótico sin sustrato adicional de alta afinidad, que puede explicar la actividad de las enzimas. capacidad de formar heterodímeros.

Los compuestos a los que se dirigen de esta manera los GST abarcan una amplia gama de toxinas ambientales o exógenas, incluidos agentes quimioterapéuticos y otras drogas, pesticidas, herbicidas, carcinógenos y epóxidos de derivados variables; de hecho, las GST son responsables de la conjugación de β₁-8,9-epóxido, un intermedio reactivo formado a partir de la aflatoxina B1, que es un medio crucial de protección contra la toxina en roedores. Las reacciones de desintoxicación comprenden los primeros cuatro pasos de la síntesis de ácido mercaptúrico, y la conjugación con GSH sirve para hacer que los sustratos sean más solubles y permite que sean eliminados de la célula mediante transportadores como la proteína 1 asociada a la resistencia a múltiples fármacos (MRP1). Después de la exportación, los productos de conjugación se convierten en ácidos mercaptúricos y se excretan a través de la orina o la bilis.

La mayoría de los isoenzimas mamíferos tienen afinidad para el sustrato 1-cloro-2,4-dinitrobenceno, y los ensayos espectrofotométricos que utilizan este sustrato se utilizan comúnmente para reportar actividad GST. Sin embargo, algunos compuestos endógenos, por ejemplo, bilirubin, pueden inhibir la actividad de los GST. En los mamíferos, las isoformas GST tienen distribuciones específicas de células (por ejemplo, α-GST en hepatocitos y π-GST en el tracto biliar del hígado humano).

Las GST desempeñan un papel en el proceso de bioactivación del profármaco clopidogrel.

Papel en la señalización celular

Aunque son más conocidos por su capacidad para conjugar xenobióticos con GSH y, por lo tanto, desintoxicar los entornos celulares, los GST también son capaces de unirse a ligandos que no son sustrato, con importantes implicaciones en la señalización celular. Se ha demostrado que varias isoenzimas GST de diversas clases inhiben la función de una quinasa implicada en la vía MAPK que regula la proliferación y muerte celular, impidiendo que la quinasa lleve a cabo su función de facilitar la cascada de señalización.

GSTP1-1 citosólico, una isoenzima bien caracterizada de la familia GST de los mamíferos, se expresa principalmente en los tejidos del corazón, los pulmones y el cerebro; de hecho, es la GST más común expresada fuera del hígado. Según su sobreexpresión en la mayoría de líneas celulares tumorales humanas y su prevalencia en tumores resistentes a la quimioterapia, se cree que GSTP1-1 desempeña un papel en el desarrollo del cáncer y su posible resistencia al tratamiento farmacológico. Más evidencia de esto proviene del conocimiento de que GSTP puede inhibir selectivamente la fosforilación de C-Jun por parte de JNK, previniendo la apoptosis. En momentos de bajo estrés celular, se forma un complejo a través de interacciones directas proteína-proteína entre GSTP y el extremo C de JNK, lo que previene eficazmente la acción de JNK y, por lo tanto, su inducción de la vía JNK. El estrés oxidativo celular provoca la disociación del complejo, la oligomerización de GSTP y la inducción de la vía JNK, lo que resulta en apoptosis. La conexión entre la inhibición de GSTP de la vía proapoptótica JNK y la sobreexpresión de la isoenzima en células tumorales resistentes a los medicamentos puede explicar en sí misma la respuesta de las células tumorales. capacidad de escapar de la apoptosis mediada por fármacos que no son sustratos de GSTP.

Al igual que GSTP, GSTM1 participa en la regulación de las vías apoptóticas a través de interacciones directas entre proteínas, aunque actúa sobre ASK1, que se encuentra aguas arriba de JNK. El mecanismo y el resultado son similares a los de GSTP y JNK, en el sentido de que GSTM1 secuestra ASK1 mediante la formación de complejos y previene su inducción de las porciones proapoptóticas p38 y JNK de la cascada de señalización MAPK. Al igual que GSTP, GSTM1 interactúa con su compañero en ausencia de estrés oxidativo, aunque ASK1 también participa en la respuesta al choque térmico, que también se previene durante el secuestro de ASK1. El hecho de que los niveles elevados de GST estén asociados con la resistencia a la apoptosis inducida por una variedad de sustancias, incluidos los agentes quimioterapéuticos, respalda su supuesto papel en la prevención de la señalización de MAPK.

Implicaciones en el desarrollo del cáncer

Existe un creciente conjunto de evidencia que respalda el papel de GST, particularmente GSTP, en el desarrollo del cáncer y la resistencia a la quimioterapia. El vínculo entre GSTP y el cáncer es más obvio en la sobreexpresión de GSTP en muchos cánceres, pero también está respaldado por el hecho de que el fenotipo transformado de las células tumorales está asociado con vías de señalización de quinasas reguladas de manera aberrante y adicción celular a proteínas sobreexpresadas. El hecho de que la mayoría de los medicamentos contra el cáncer sean sustratos deficientes para el GSTP indica que la función del GSTP elevado en muchas líneas celulares tumorales no es desintoxicar los compuestos, sino que debe tener otro propósito; Esta hipótesis también recibe credibilidad por el hallazgo común de sobreexpresión de GSTP en líneas celulares tumorales que no son resistentes a los medicamentos.

Importancia clínica

Además de su papel en el desarrollo del cáncer y la resistencia a los fármacos quimioterapéuticos, los GST están implicados en una variedad de enfermedades en virtud de su relación con el GSH. Aunque la evidencia es mínima sobre la influencia de los polimorfismos GST de las clases alfa, mu, pi y theta sobre la susceptibilidad a diversos tipos de cáncer, numerosos estudios han implicado tales variaciones genotípicas en el asma, la aterosclerosis, las alergias y otras enfermedades inflamatorias.

Debido a que la diabetes es una enfermedad que implica daño oxidativo y el metabolismo del GSH es disfuncional en pacientes diabéticos, los GST pueden representar un objetivo potencial para el tratamiento farmacológico de la diabetes. Además, se sabe que la administración de insulina produce un aumento de la expresión del gen GST a través de la vía PI3K/AKT/mTOR y una reducción del estrés oxidativo intracelular, mientras que el glucagón disminuye dicha expresión génica.

Los genes GST de clase omega (GSTO), en particular, están asociados con enfermedades neurológicas como el Alzheimer, el Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica; Una vez más, se cree que el estrés oxidativo es el culpable, ya que la disminución de la expresión del gen GSTO da como resultado una menor edad de aparición de las enfermedades.

Liberación de GST como indicación de daño orgánico

Las altas concentraciones intracelulares de GST, junto con su distribución celular específica de cada célula, les permiten funcionar como biomarcadores para localizar y monitorear lesiones en tipos de células definidos. Por ejemplo, los hepatocitos contienen altos niveles de alfa GST y se ha descubierto que la alfa GST sérica es un indicador de lesión de hepatocitos en trasplantes, toxicidad e infecciones virales.

De manera similar, en los seres humanos, las células del túbulo proximal renal contienen altas concentraciones de alfa GST, mientras que las células del túbulo distal contienen pi GST. Esta distribución específica permite utilizar la medición de GST urinarias para cuantificar y localizar la lesión tubular renal en trasplantes, nefrotoxicidad y lesión isquémica.

En estudios preclínicos con roedores, se ha demostrado que la alfa GST en orina y suero son indicadores sensibles y específicos de la necrosis del túbulo proximal renal y de los hepatocitos, respectivamente.

Etiquetas GST y ensayo desplegable de GST

Se puede agregar GST a una proteína de interés para purificarla de la solución en un proceso conocido como ensayo desplegable. Esto se logra insertando la secuencia codificante del ADN GST junto a la que codifica la proteína de interés. Así, después de la transcripción y traducción, la proteína GST y la proteína de interés se expresarán juntas como una proteína de fusión. Debido a que la proteína GST tiene una fuerte afinidad de unión por el GSH, se pueden añadir perlas recubiertas con el compuesto a la mezcla de proteínas; como resultado, la proteína de interés unida al GST se adherirá a las perlas, aislando la proteína del resto de las que están en solución. Las perlas se recuperan y se lavan con GSH libre para separar la proteína de interés de las perlas, lo que da como resultado una proteína purificada. Esta técnica se puede utilizar para dilucidar las interacciones directas entre proteínas. Un inconveniente de este ensayo es que la proteína de interés está unida a GST, alterando su estado nativo.

A menudo se utiliza una etiqueta GST para separar y purificar proteínas que contienen la proteína de fusión GST. La etiqueta tiene un tamaño de 220 aminoácidos (aproximadamente 26 kDa), que, en comparación con etiquetas como Myc-tag o FLAG-tag, es bastante grande. Puede fusionarse al extremo N o al extremo C de una proteína. Además de funcionar como etiqueta de purificación, GST actúa como chaperona de la proteína adherida, promoviendo su correcto plegamiento, además de evitar que se agregue en cuerpos de inclusión cuando se expresa en bacterias. La etiqueta GST se puede eliminar fácilmente después de la purificación mediante la adición de trombina proteasa si se ha insertado un sitio de escisión adecuado entre la etiqueta GST y la proteína de interés (que normalmente se incluye en muchas fuentes comercialmente disponibles de plásmidos etiquetados con GST).