Glutamato deshidrogenasa 1

GLUD1 (glutamato deshidrogenasa 1) es una enzima de la matriz mitocondrial, perteneciente a la familia de las glutamato deshidrogenasas que son omnipresentes en la vida, con un papel clave en el nitrógeno y el glutamato. Metabolismo (Glu) y homeostasis energética. Esta deshidrogenasa se expresa en niveles elevados en el hígado, el cerebro, el páncreas y los riñones, pero no en los músculos. En las células pancreáticas, se cree que GLUD1 participa en los mecanismos de secreción de insulina. En el tejido nervioso, donde el glutamato está presente en concentraciones más altas que en otros tejidos, GLUD1 parece funcionar tanto en la síntesis como en el catabolismo del glutamato y quizás en la desintoxicación del amoníaco.

Estructura

Gen

El GLUD1 humano contiene 13 exones y está ubicado en el décimo cromosoma.

Existe evidencia de que GLUD1 se ha retropuesto al cromosoma X, donde dio lugar al GLUD2 sin intrones mediante mutaciones aleatorias y selección natural. GLUD2 se han adaptado a las necesidades particulares del sistema nervioso donde se expresa específicamente.

Proteína

GLUD1 es un hexámero. La unidad de monómero tiene:

1. N-terminal Glu-BD( Dominio Binding) que se compone principalmente de β-strands.
2. NAD-BD - puede atar o NAD⁺ o PNA⁺.
3. Presión de antena de 48 residuos que se extiende desde la parte superior de cada NAD-BD. La antena consiste en una helix ascendente y una espiral descendente al azar que contiene un pequeño α-helix hacia el extremo C-terminal de la hebra.

NAD-BD se encuentra encima de Glu-BD. NAD-BD y Glu-BD forman la hendidura catalítica. Durante la unión del sustrato, el NAD-BD se mueve significativamente. Este movimiento tiene dos componentes: gira a lo largo del eje largo de una hélice en la parte posterior del NAD-BD, llamada "hélice de pivote", y gira alrededor de la antena en el sentido de las agujas del reloj. Una comparación de las conformaciones abierta y cerrada de GLUD1 revela cambios en la pequeña hélice de la hebra descendente de la antena, que parece retroceder a medida que se abre la hendidura catalítica. El cierre de una subunidad se asocia con la distorsión de la pequeña hélice de la hebra descendente que se empuja hacia la antena de la subunidad adyacente. R496 se encuentra en esta pequeña hélice (ver Mutaciones).

La estructura central del hexámero es un dímero apilado de trímeros. Los Glu-BD de los monómeros son los principales responsables de la formación del núcleo. La posición relativa de los monómeros es tal que la rotación alrededor de la hélice de pivote en cada monómero no está restringida. Las antenas de tres subunidades dentro de los trímeros se envuelven entre sí y sufren cambios conformacionales a medida que la hendidura catalítica se abre y se cierra. La antena sirve como conducto de comunicación entre subunidades durante la cooperatividad negativa y la regulación alostérica.

La alineación de GLUD1 de diversas fuentes muestra que la antena probablemente evolucionó en el protista antes de la formación de sitios reguladores de purina. Esto sugiere que existe alguna ventaja selectiva de la propia antena y que los animales desarrollaron nuevas funciones para GLUD1 mediante la adición de regulación alostérica.

GLUD1 puede formar fibras largas mediante la asociación de los hexámeros de extremo a extremo. La polimerización no está relacionada con la actividad catalítica, pero probablemente tiene un papel importante como la formación de complejos multienzimáticos.

GLUD1 tiene dos sitios de unión de coenzimas: uno en el NAD-BD que es capaz de unirse al éter NAD+ o NADP⁺ y está directamente involucrado en el proceso catalítico, y un segundo, que tiene una función reguladora, situada directamente debajo de la hélice pivote, que puede unirse a ADP, NAD⁺ o NADH, pero no se une bien a NADPH.

Función

GLUD1 cataliza la desaminación oxidativa de Glu a 2-oxoglutarato y NH₄⁺ libre utilizando NAD⁺ o NADP⁺ como cofactor. La reacción se produce con la transferencia de un ion hidruro de Glu's Cα a NAD(P)⁺, formando así 2-iminoglutarato, que se hidroliza a 2-oxoglutarato y NH_4. ⁺. El equilibrio de la reacción en circunstancias estándar favorece en gran medida la formación de Glu sobre la formación de NH₄⁺ (Go' ~ 30 kJ.mol-1). Por esta razón, se pensó que la enzima desempeñaba un papel importante en la desintoxicación del amoníaco, ya que dado que los niveles altos de [NH₄⁺] son tóxicos, esta posición de equilibrio sería fisiológicamente importante. ; ayudaría a mantener niveles bajos de [NH₄⁺]. Sin embargo, en individuos con cierta forma de hiperamonemia resultante de una forma de hiperinsulinismo, la actividad de la enzima aumenta debido a la disminución de la sensibilidad al GTP, un regulador negativo. Los niveles de amoníaco en sangre de estos individuos aumentan significativamente, lo que no se esperaría si la enzima realmente operara en equilibrio.

Interacciones

Socios vinculantes

ADP

El ADP se une detrás del NAD-BD, justo debajo de la hélice pivote, en el sitio alostérico especial del ADP. La fracción adenosina se une a una bolsa hidrófoba, con los grupos ribosa fosfato apuntando hacia el sitio alostérico de GTP.

El NADH también puede unirse al sitio del ADP, cuando está en altas concentraciones, lo que generalmente resulta en la inhibición de la enzima.

GTP

La unión de GTP es antagonizada por P_i y ADP, pero es sinérgica con la unión de NADH en el sitio alostérico no catalítico. La mayoría de los contactos entre GTP y la enzima se realizan a través del resto trifosfato. Se considera que el sitio de unión de GTP es el "sensor" que desactiva la enzima cuando la célula se encuentra en un estado de alta energía. El GTP se une en la unión entre el NAD-BD y la antena.

Mientras que la mayoría de las interacciones GLUD1-GTP se producen a través de interacciones β- y γ-fosfato, existen interacciones específicas con E346 y K343 que favorecen la guanosina sobre la adenosina.

En la conformación abierta, el sitio de unión de GTP está distorsionado de tal manera que ya no puede unirse a GTP.

Reglamento

Cuando GLUD1 está altamente saturado con los ligandos del sitio activo (sustratos), se forma un complejo abortivo inhibidor en el sitio activo: NAD(P)H.Glu en la reacción de desaminación oxidativa a pH alto, y NAD(P)⁺.2-oxoglutarato en la reacción de aminación reductora a pH bajo. GLUD1 asume su configuración de estado basal en ausencia de efectores alostéricos, independientemente de si los sitios alostéricos son funcionales. Los reguladores alostéricos de GLUD1 (ADP, GTP, Leu, NAD⁺ y NADH) ejercen sus efectos cambiando la energía necesaria para abrir y cerrar la hendidura catalítica durante el recambio enzimático, en otras palabras, desestabilizando o estabilizando , respectivamente, los complejos abortivos. Los activadores no son necesarios para la función catalítica de GLUD1, ya que está activo en ausencia de estos compuestos (estado basal). Se ha sugerido que GLUD1 asume en su estado basal una configuración (hendidura catalítica abierta) que permite la actividad catalítica independientemente de si los sitios alostéricos son funcionales. La regulación de GLUD es de particular importancia biológica, como lo demuestran las observaciones que muestran que las mutaciones reguladoras de GLUD1 están asociadas con manifestaciones clínicas en niños.

ADP

Siendo el ADP uno de los dos activadores principales (NAD⁺ es el otro), actúa desestabilizando los complejos abortivos y anulando la cooperatividad negativa. En ausencia de sustratos y con ADP unido, la hendidura catalítica está en conformación abierta y los hexámeros GLUD1 forman polímeros largos en la celda cristalina con más interacciones que las que se encuentran en los cristales complejos abortivos (8AR8). Esto es consistente con el hecho de que ADP promueve la agregación en la solución. Cuando se abre la hendidura catalítica, el R516 gira hacia los fosfatos de ADP. La apertura de la hendidura catalítica se correlaciona aproximadamente con la distancia entre R516 y los fosfatos de ADP. De esta manera, el ADP activa GLUD1 facilitando la apertura de la hendidura catalítica, lo que disminuye la afinidad del producto y facilita la liberación del producto. permitiendo así que GLUD1 reconcilie los complejos abortivos no catalíticos.

Se ha sugerido anteriormente que la inhibición por [ADP] elevado se debe a la competencia entre el ADP y la fracción adenosina de la coenzima en el sitio activo1. Al menos se sabe que el efecto no se ve relativamente afectado ni por el H507Y ni por el R516A.

ATP

El ATP tiene efectos complejos que dependen de la concentración sobre la actividad GLUD1:

• Bajo [ATP] - inhibición, mediada a través del sitio de unión GTP, ya que es eliminado por H507Y. La afinidad de ATP para el sitio GTP parece ser 1000 veces más baja que para GTP, ya que las interacciones β- y γ-fosfato son el principal determinante de la unión en el sitio GTP.
• Intermediate [ATP] - activación, mediada a través del sitio del efector ADP, ya que es casi completamente eliminado por R516A. En este sitio el grupo nucleótido es el principal determinante de la unión.
• Alto [ATP] - inhibición, mediada por débil unión en un tercer sitio, que es relativamente específico para los nucleótidos de adenina. Este efecto es relativamente no afectado por H507Y o R516A. Como se sugirió para el ADP podría ser debido a una competencia entre ATP y la mezcla adenosina de la coenzima en el sitio activo.

GTP

GTP inhibe el recambio enzimático en una amplia gama de condiciones al aumentar la afinidad de GLUD1 por el producto de reacción, lo que hace que la tasa de liberación del producto sea limitante en todas las condiciones en presencia de GTP. El GTP actúa manteniendo la hendidura catalítica en una conformación cerrada, estabilizando así los complejos abortivos. Los efectos del GTP sobre GLUD1 no se localizan únicamente en la subunidad a la que se une y la antena juega un papel importante en la comunicación de esta inhibición a otras subunidades.

Leu

Leu activa GLUD1 independientemente del ADP, poseyendo un sitio alostérico especial en el área de interfaz de las subunidades 8AR7. Las respuestas mejoradas de los pacientes HI/HA (ver Síndrome HI/HA) a la estimulación de Leu de la liberación de INS3, que resultan de su sensibilidad alterada a la inhibición de GTP, enfatizan la importancia fisiológica del control inhibidor de GLUD1.

NAD+

NAD(P)(H) puede unirse a un segundo sitio en cada subunidad. Este sitio se une a NAD(H) ~ 10 veces mejor que NADP(H), siendo las formas reducidas mejor que las formas oxidadas. Aunque se ha sugerido que la unión de la coenzima reducida en este sitio inhibe la reacción, mientras que la unión de la coenzima oxidada provoca la activación, el efecto aún no está claro.

NADH

NADH, es otro importante inhibidor alostérico de GLUD1.

Fosfato

El fosfato y otros aniones bivalentes estabilizan GLUD1. Estudios estructurales recientes han demostrado que las moléculas de fosfato se unen al sitio GTP.

Importancia clínica

El hiperinsulinismo familiar, relacionado con mutaciones en GLUD1, se caracteriza por hipoglucemia que varía desde una enfermedad grave de inicio neonatal y difícil de controlar hasta una enfermedad de inicio en la niñez con síntomas leves e hipoglucemia difícil de diagnosticar. La enfermedad de inicio neonatal se manifiesta entre horas y dos días después del nacimiento. La enfermedad de inicio en la infancia se manifiesta durante los primeros meses o años de vida. En el período neonatal, los síntomas de presentación pueden ser inespecíficos, incluyendo convulsiones, hipotonía, mala alimentación y apnea. En los casos graves, las concentraciones séricas de glucosa suelen ser extremadamente bajas y, por tanto, fáciles de reconocer, mientras que en los casos más leves, la hipoglucemia variable y leve puede dificultar el diagnóstico. Incluso dentro de la misma familia, las manifestaciones de la enfermedad pueden variar de leves a graves. Las personas con hiperinsulinismo familiar autosómico recesivo, causado por mutaciones en ABCC8 o KCNJ11 (FHI-KATP), tienden a ser grandes para la edad gestacional y por lo general presentan hipoglucemia refractaria grave en las primeras 48 horas de vida; Los lactantes afectados suelen responder sólo parcialmente a la dieta o al tratamiento médico (es decir, tratamiento con diazóxido) y, por tanto, pueden requerir resección pancreática. Las personas con FHI-KATP autosómica dominante tienden a ser apropiadas para la edad gestacional al nacer, presentarse aproximadamente al año de edad (rango: 2 días - 30 años) y responder a la dieta y al tratamiento con diazóxido. Se han informado excepciones a ambas generalidades. FHI-GCK, causada por mutaciones en GCK, puede ser mucho más leve que FHI-KATP; sin embargo, algunas personas tienen hipoglucemia grave que no responde al diazóxido. FHI-HADH, causada por mutaciones en HADH, tiende a ser relativamente leve, aunque se han informado casos graves. Las personas con FHI-HNF4A, causada por mutaciones en HNF4A, generalmente nacen grandes para la edad gestacional y tienen características leves que responden al tratamiento con diazóxido. FHI-UCP2, causado por mutaciones en UCP2, es una causa poco común de FH1 que responde al diazóxido. La hiperamonemia/hiperinsulinismo (HA/HI) se asocia con hiperamonemia leve a moderada y con hipoglucemia relativamente leve de aparición tardía; la mayoría, pero no todos, los individuos afectados tienen mutaciones en GLUD1.

Características clínicas

FHI se caracteriza por una hipoglucemia que varía desde una enfermedad grave de inicio neonatal y difícil de controlar hasta una enfermedad de inicio en la niñez con síntomas leves e hipoglucemia difícil de diagnosticar. La enfermedad de inicio neonatal se manifiesta entre horas y dos días después del nacimiento. La enfermedad de inicio en la infancia se manifiesta durante los primeros meses o años de vida. En el período neonatal, los síntomas de presentación pueden ser inespecíficos, incluyendo convulsiones, hipotonía, mala alimentación y apnea. En los casos graves, las concentraciones séricas de glucosa suelen ser extremadamente bajas y, por tanto, fáciles de reconocer, mientras que en los casos más leves, la hipoglucemia variable y leve puede dificultar el diagnóstico. Incluso dentro de la misma familia, las manifestaciones de la enfermedad pueden variar de leves a graves.

Diagnóstico/pruebas

Aproximadamente el 45 % de las personas afectadas tienen mutaciones en ABCC8, que codifica la proteína SUR1, o en KCNJ11, que codifica la proteína Kir6.2. En la población judía asquenazí, dos mutaciones fundadoras de ABCC8 son responsables de aproximadamente el 97% de los FHI. Otras mutaciones fundadoras de ABCC8 están presentes en la población finlandesa (p. Val187Asp y p.Asp1506Lys). Las mutaciones en GLUD1 y HNF4A representan cada una aproximadamente el 5% de las personas con FHI. Las mutaciones activadoras en GCK o las mutaciones inactivadoras en HADH ocurren en menos del 1% de los individuos con FHI. Hasta la fecha, solo se han informado mutaciones en UCP2 en dos familias. Aproximadamente el 40% de las personas con FHI no tienen una mutación identificable en ninguno de los genes que se sabe que están asociados con FHI.

Gestión

En el diagnóstico inicial, la hipoglucemia se corrige con glucosa intravenosa para normalizar la concentración de glucosa en plasma y prevenir el daño cerebral. El tratamiento médico a largo plazo incluye el uso de diazóxido, análogos de la somatostatina, nifedipina, glucagón, IGF-I recombinante, glucocorticoides, hormona del crecimiento humano, intervención dietética o combinaciones de estas terapias. En individuos en quienes el tratamiento médico agresivo no logra mantener la concentración de glucosa plasmática dentro de límites seguros, o en quienes dicho tratamiento no puede mantenerse de manera segura en el tiempo, se considera la resección pancreática.