Glutamato descarboxilasa

La Glutamato descarboxilasa o ácido glutámico descarboxilasa (GAD) es una enzima que cataliza la descarboxilación del glutamato a ácido gamma-aminobutírico (GABA) y dióxido de carbono (CO₂). GAD utiliza piridoxal-fosfato (PLP) como cofactor. La reacción procede de la siguiente manera:

HOOC−CH₂Č₂(NH)₂) - COH → CO₂ + HOOC−CH₂Č₂Č₂NH₂

En los mamíferos, GAD existe en dos isoformas con pesos moleculares de 67 y 65 kDa (GAD₆₇ y GAD₆₅), que están codificadas por dos genes diferentes en diferentes cromosomas (genes GAD1 y GAD2, cromosomas 2 y 10 en humanos, respectivamente). GAD₆₇ y GAD₆₅ se expresan en el cerebro donde se utiliza GABA como neurotransmisor, y también se expresan en las células β del páncreas productoras de insulina, en proporciones variables dependiendo de la especie. Juntas, estas dos enzimas mantienen el principal suministro fisiológico de GABA en los mamíferos, aunque también puede sintetizarse a partir de la putrescina en el sistema nervioso entérico, el cerebro y otros lugares mediante las acciones de la diaminooxidasa y la aldehído deshidrogenasa 1a1.

Varias transcripciones truncadas y polipéptidos de GAD₆₇ son detectables en el cerebro en desarrollo, sin embargo su función, si la hay, es desconocida.

Estructura y mecanismo

Ambas isoformas de GAD son estructuras homodiméricas que constan de 3 dominios primarios: los dominios PLP, C-terminal y N-terminal. El dominio de unión a PLP de esta enzima adopta un pliegue tipo transferasa dependiente de PLP tipo I. La reacción se produce a través del mecanismo canónico, que implica el enlace de bases de Schiff entre PLP y Lys405. El PLP se mantiene en su lugar mediante el apilamiento de bases con un residuo de histidina adyacente, y el GABA se coloca de manera que su grupo carboxilo forme un puente salino con arginina y un enlace de hidrógeno con glutamina.

La dimerización es esencial para mantener la función, ya que el sitio activo se encuentra en esta interfaz, y las mutaciones que interfieren con la asociación óptima entre las 2 cadenas se han relacionado con patologías como la esquizofrenia. También se demostró que la interferencia de la dimerización por inhibidores de GAD como el ácido 2-ceto-4-pentenoico (KPA) y el cetopentenoato de etilo (EKP) conduce a reducciones dramáticas en la producción de GABA y la incidencia de convulsiones.

La actividad catalítica está mediada por un bucle corto y flexible en la interfaz del dímero (residuos 432–442 en GAD67 y 423–433 en GAD65). En GAD67, este bucle permanece atado, cubriendo el sitio activo y proporcionando un entorno catalítico para sostener la producción de GABA; su movilidad en GAD65 promueve una reacción secundaria que resulta en la liberación de PLP, lo que lleva a la autoinactivación. La conformación de este bucle está íntimamente ligada al dominio C-terminal, que también afecta la tasa de autoinactivación. Además, el GAD65 unido a GABA es intrínsecamente más flexible y existe como un conjunto de estados, lo que brinda más oportunidades de autoantigenicidad como se observa en la diabetes tipo 1. El GAD derivado de Escherichia coli muestra complejidades estructurales adicionales, incluido un cambio conformacional dependiente del pH. Este comportamiento se define por la presencia de un haz de triple hélice formado por los extremos N de la proteína hexamérica en ambientes ácidos.

Regulación de GAD65 y GAD67

A pesar de una gran similitud de secuencia entre los dos genes, GAD65 y GAD67 cumplen funciones muy diferentes dentro del cuerpo humano. Además, la investigación sugiere que GAD65 y GAD67 están regulados por mecanismos celulares claramente diferentes.

GAD₆₅ y GAD₆₇ sintetizan GABA en diferentes lugares de la célula, en diferentes momentos de desarrollo y para propósitos funcionalmente diferentes. GAD₆₇ se distribuye uniformemente por toda la célula, mientras que GAD₆₅ se localiza en las terminales nerviosas. GAD₆₇ sintetiza GABA para la actividad neuronal no relacionada con la neurotransmisión, como la sinaptogénesis y la protección contra lesiones neuronales. Esta función requiere la presencia generalizada y ubicua de GABA. GAD₆₅, sin embargo, sintetiza GABA para la neurotransmisión y, por lo tanto, solo es necesario en las terminales nerviosas y las sinapsis. Para ayudar en la neurotransmisión, GAD₆₅ forma un complejo con el equivalente 70 del choque térmico (HSC₇₀), la proteína de cadena de cisteína (CSP) y el transportador vesicular GABA VGAT, que, como complejo, ayuda a empaquetar el GABA en vesículas para su liberación durante la neurotransmisión. GAD₆₇ se transcribe durante el desarrollo temprano, mientras que GAD₆₅ no se transcribe hasta una etapa más avanzada de la vida. Esta diferencia de desarrollo en GAD₆₇ y GAD₆₅ refleja las propiedades funcionales de cada isoforma; GAD₆₇ es necesario durante todo el desarrollo para el funcionamiento celular normal, mientras que GAD₆₅ no es necesario hasta un poco más tarde en el desarrollo, cuando la inhibición sináptica es más frecuente.

GAD₆₇ y GAD₆₅ también se regulan de manera diferente postraduccionalmente. Tanto GAD₆₅ como GAD₆₇ se regulan mediante la fosforilación de un bucle catalítico dinámico, pero la regulación de estas isoformas difiere; GAD₆₅ se activa mediante fosforilación mientras que GAD₆₇ se inhibe mediante fosforilación. GAD67 se encuentra predominantemente activado (~92%), mientras que GAD65 se encuentra predominantemente inactivado (~72%). GAD₆₇ está fosforilado en la treonina 91 por la proteína quinasa A (PKA), mientras que GAD₆₅ está fosforilado y, por lo tanto, regulado por la proteína quinasa C (PKC). Tanto GAD₆₇ como GAD₆₅ también están regulados postraduccionalmente por piridoxal 5'-fosfato (PLP); GAD se activa cuando está vinculado a PLP y está inactivo cuando no está vinculado a PLP. La mayoría de GAD₆₇ está unida a PLP en un momento dado, mientras que GAD₆₅ se une a PLP cuando se necesita GABA para la neurotransmisión. Esto refleja las propiedades funcionales de las dos isoformas; GAD₆₇ debe estar activo en todo momento para el funcionamiento celular normal y, por lo tanto, el PLP lo activa constantemente, mientras que GAD₆₅ solo debe activarse cuando ocurre la neurotransmisión GABA y, por lo tanto, es regulado según el entorno sináptico.

Los estudios con ratones también muestran diferencias funcionales entre Gad67 y Gad65. Los ratones GAD67-/- nacen con paladar hendido y mueren un día después del nacimiento, mientras que los ratones GAD65-/- sobreviven con una tendencia ligeramente mayor a las convulsiones. Además, GAD65+/- tiene síntomas definidos de manera similar al trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) en humanos.

Papel en el sistema nervioso

Tanto GAD67 como GAD65 están presentes en todo tipo de sinapsis dentro del sistema nervioso humano. Esto incluye sinapsis dendrodendríticas, axosomáticas y axodendríticas. La evidencia preliminar sugiere que GAD65 es dominante en los sistemas visual y neuroendocrino, que experimentan cambios más fásicos. También se cree que GAD67 está presente en cantidades mayores en las neuronas tónicamente activas.

Papel en patología

Autismo

Tanto GAD65 como GAD67 experimentan una regulación negativa significativa en los casos de autismo. En una comparación de cerebros autistas versus cerebros de control, GAD65 y GAD67 experimentaron una regulación negativa promedio del 50% en las cortezas parietal y cerebelosa de los cerebros autistas. Las células cerebelosas de Purkinje también informaron una regulación negativa del 40%, lo que sugiere que los núcleos cerebelosos afectados pueden alterar la salida a áreas motoras y cognitivas de orden superior del cerebro.

Diabetes

Tanto GAD₆₇ como GAD₆₅ son objetivos de autoanticuerpos en personas que posteriormente desarrollan diabetes mellitus tipo 1 o diabetes autoinmune latente. Se ha demostrado que las inyecciones de GAD₆₅ en formas que inducen tolerancia inmune previenen la diabetes tipo 1 en modelos de roedores. En ensayos clínicos, se ha demostrado que las inyecciones de GAD₆₅ preservan parte de la producción de insulina durante 30 meses en humanos con diabetes tipo 1. Una revisión sistemática Cochrane también examinó 1 estudio que muestra una mejora de los niveles de péptido C en casos de diabetes autoinmune latente en adultos, 5 años después del tratamiento con GAD₆₅. Aún así, es importante resaltar que los estudios disponibles para ser incluidos en esta revisión presentó fallas considerables en calidad y diseño.

Síndrome de la persona rígida

Los títulos elevados de autoanticuerpos contra la descarboxilasa del ácido glutámico (GAD) están bien documentados en asociación con el síndrome de la persona rígida (SPS). La descarboxilasa del ácido glutámico es la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de ácido γ-aminobutírico (GABA), y la función alterada de las neuronas GABAérgicas se ha implicado en la patogénesis del SPS. Los autoanticuerpos contra el GAD podrían ser el agente causal o un marcador de la enfermedad.

Esquizofrenia y trastorno bipolar

En la esquizofrenia y el trastorno bipolar se observa una desregulación sustancial de la expresión del ARNm de GAD, junto con una regulación negativa de la reelina. La regulación negativa más pronunciada de GAD₆₇ se encontró en la capa oriental del hipocampo en ambos trastornos y en otras capas y estructuras del hipocampo en diversos grados.

GAD₆₇ es una enzima clave involucrada en la síntesis del neurotransmisor inhibidor GABA y se ha demostrado que las personas con esquizofrenia expresan menores cantidades de GAD₆₇ en la corteza prefrontal dorsolateral. en comparación con controles sanos. El mecanismo subyacente a la disminución de los niveles de GAD₆₇ en personas con esquizofrenia aún no está claro. Algunos han propuesto que un gen temprano inmediato, Zif268, que normalmente se une a la región promotora de GAD₆₇ y aumenta la transcripción de GAD₆₇, es menor en pacientes esquizofrénicos, contribuyendo así a niveles reducidos de GAD₆₇. Dado que la corteza prefrontal dorsolateral (DLPFC) está implicada en la memoria de trabajo, y los niveles de ARNm de GAD₆₇ y Zif268 son más bajos en la DLPFC de pacientes esquizofrénicos, esta alteración molecular puede explicar, al menos en parte, la Deterioros de la memoria de trabajo asociados con la enfermedad.

Enfermedad de Parkinson

La administración bilateral de ácido glutámico descarboxilasa (GAD) mediante un vector viral adenoasociado en el núcleo subtalámico de pacientes de entre 30 y 75 años con enfermedad de Parkinson avanzada, progresiva y sensible a la levodopa dio como resultado una mejora significativa con respecto al valor inicial durante el curso de un estudio de seis meses.

Trastornos cerebelosos

La administración intracerebelosa de autoanticuerpos GAD a animales aumenta la excitabilidad de las motoneuronas y altera la producción de óxido nítrico (NO), una molécula implicada en el aprendizaje. El reconocimiento de epítopos contribuye a la afectación del cerebelo. Los niveles reducidos de GABA aumentan los niveles de glutamato como consecuencia de una menor inhibición de los subtipos de receptores GABA. Los niveles más altos de glutamato activan la microglía y la activación de xc(-) aumenta la liberación extracelular de glutamato.

Dolor neuropático

La lesión del nervio periférico del nervio ciático (un modelo de dolor neuropático) induce una pérdida transitoria de terminales inmunorreactivos GAD₆₅ en el asta dorsal de la médula espinal y sugiere una posible implicación de estas alteraciones en el desarrollo y mejora de la conducta dolorosa.

Otros trastornos neurológicos asociados a anti-TAG

Los anticuerpos dirigidos contra la descarboxilasa del ácido glutámico (GAD) se encuentran cada vez más en pacientes con otros síntomas indicativos de disfunción del sistema nervioso central (SNC), como ataxia, encefalomielitis progresiva con rigidez y mioclonías (PERM), encefalitis límbica y epilepsia. El patrón de anticuerpos anti-GAD en la epilepsia difiere del de la diabetes tipo 1 y del síndrome de la persona rígida.

Papel de la glutamato descarboxilasa en otros organismos

Además de la síntesis de GABA, GAD tiene funciones adicionales y variaciones estructurales que dependen del organismo. En Saccharomyces cerevisiae, GAD se une a la proteína reguladora de Ca²⁺ calmodulina (CaM) y también participa en la respuesta al estrés oxidativo. De manera similar, el GAD en las plantas también se une a la calmodulina. Esta interacción ocurre en el dominio de unión a CAM (CaMBD) de 30-50 pb en su extremo C y es necesaria para la regulación adecuada de la producción de GABA. A diferencia de los vertebrados e invertebrados, el GABA producido por GAD se utiliza en las plantas para señalar el estrés abiótico mediante el control de los niveles de Ca²⁺ intracelular a través de CaM. La unión a CaM abre canales de Ca²⁺ y conduce a un aumento en las concentraciones de Ca²⁺ en el citosol, permitiendo que Ca²⁺ actúe como un mensajero secundario y activar vías posteriores. Cuando GAD no está unido a CaM, CaMBD actúa como un dominio autoinhibidor, desactivando así GAD en ausencia de estrés. Curiosamente, en dos especies de plantas, el arroz y las manzanas, se han descubierto isoformas de GAD independientes de Ca2+/CAM. El extremo C de estas isoformas contiene sustituciones en residuos clave necesarios para interactuar con CaM en CaMBD, evitando que la proteína se una a GAD. Mientras que CaMBD de la isoforma del arroz todavía funciona como un dominio autoinhibidor, el extremo C terminal de la isoforma de las manzanas no lo hace. Finalmente, la estructura del GAD vegetal es un hexámero y tiene actividad dependiente del pH, con un pH óptimo de 5,8 en múltiples especies. pero también actividad significativa a pH 7,3 en presencia de CaM

También se cree que el control de la glutamato descarboxilasa tiene la posibilidad de mejorar la calidad de los productos cítricos poscosecha. En las plantas de cítricos, las investigaciones han demostrado que la glutamato descarboxilasa desempeña un papel clave en el metabolismo del citrato. Con el aumento de la glutamato descarboxilasa a través de la exposición directa, se ha observado que los niveles de citrato aumentan significativamente dentro de las plantas y, en conjunto, el mantenimiento de la calidad poscosecha mejoró significativamente y las tasas de pudrición disminuyeron.

Al igual que el GAD en las plantas, el GAD en E. coli tiene una estructura hexámera y es más activa en condiciones de pH ácido; el pH óptimo para E. coli GAD es 3,8-4,6. Sin embargo, a diferencia de las plantas y las levaduras, el GAD en E. coli no requiere la unión de calmodulina para funcionar. También hay dos isoformas de GAD, a saber, GadA y GadB, codificadas por genes separados en E. coli, aunque ambas isoformas son bioquímicamente idénticas. La enzima desempeña un papel importante a la hora de conferir resistencia a los ácidos y permite que las bacterias sobrevivan temporalmente en entornos muy ácidos (pH <2,5) como el estómago. Esto se hace al GAD descarboxilar el glutamato a GABA, lo que requiere que H+ sea absorbido como reactivo y eleva el pH dentro de las bacterias. Luego, GABA se puede exportar fuera de E. coli y contribuyen a aumentar el pH de los ambientes extracelulares cercanos.