Fragmento de Klenow

El fragmento Klenow es un fragmento proteico grande producido cuando la ADN polimerasa I de E. coli es escindida enzimáticamente por la proteasa subtilisina. Reportado por primera vez en 1970, conserva el tamaño de 5' → 3' actividad polimerasa y la actividad exonucleasa 3' → 5' para la eliminación de nucleótidos precodificantes y corrección, pero pierde su actividad 5' → 3' actividad exonucleasa.

El otro fragmento más pequeño se formó cuando la ADN polimerasa I de E. coli se escinde mediante subtilisina y conserva el 5' → 3' actividad exonucleasa pero no tiene las otras dos actividades exhibidas por el fragmento de Klenow (es decir, actividad polimerasa 5' → 3' y actividad exonucleasa 3' → 5').

Investigación

Porque el 5' → 3' Actividad exonucleasa de la ADN polimerasa I de E. coli lo hace inadecuado para muchas aplicaciones, el fragmento de Klenow, que carece de esta actividad, puede ser muy útil en la investigación. El fragmento de Klenow es extremadamente útil para tareas basadas en investigación como:

• Síntesis del ADN de doble tirada de plantillas de una sola hoja
• Llenado en 3' extremos recados de fragmentos de ADN para hacer 5' sobrehang contundente
• Digesting away protruding 3' overhangs
• Preparación de sondas radiactivas de ADN

El fragmento Klenow también fue la enzima original utilizada para amplificar en gran medida segmentos de ADN en el proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), antes de ser reemplazado por enzimas termoestables como la Taq polimerasa.

El fragmento exo-Klenow

Al igual que el 5' → 3' La actividad exonucleasa de la ADN polimerasa I de E.coli puede ser indeseable, el 3' → 5' La actividad exonucleasa del fragmento de Klenow también puede ser indeseable para determinadas aplicaciones. Este problema puede superarse introduciendo mutaciones en el gen que codifica Klenow. Esto da como resultado que se expresen formas de la enzima que retienen 5' → 3' actividad polimerasa, pero carecen de actividad exonucleasa (5' → 3' o 3' → 5'). Esta forma de enzima se llama fragmento exo-Klenow.

El fragmento exo-Klenow se utiliza en algunas reacciones de marcaje fluorescente para microarrays, y también en la cola dA y dT, un paso importante en el proceso de ligar adaptadores de ADN a fragmentos de ADN, frecuentemente utilizado en la preparación de bibliotecas de ADN para Next-Gen. secuenciación. (por ejemplo ver [1])