Fragmentación (biología celular)

La fragmentación describe el proceso de división en varias piezas o fragmentos. En biología celular, la fragmentación es útil para una célula tanto durante la clonación de ADN como durante la apoptosis. La clonación de ADN es importante en la reproducción asexual o la creación de moléculas de ADN idénticas, y puede ser realizada espontáneamente por la célula o intencionalmente por investigadores de laboratorio. La apoptosis es la destrucción programada de células y de las moléculas de ADN que contienen, y es un proceso altamente regulado. Estas dos formas en las que se utiliza la fragmentación en los procesos celulares describen funciones celulares normales y procedimientos de laboratorio comunes que se realizan con las células. Sin embargo, los problemas dentro de una célula a veces pueden causar fragmentación que da como resultado irregularidades como la fragmentación de glóbulos rojos y la fragmentación del ADN de los espermatozoides.

La clonación de ADN puede ser realizada de forma espontánea por la célula con fines reproductivos. Se trata de una forma de reproducción asexual en la que un organismo se divide en fragmentos y luego cada uno de estos fragmentos se convierte en individuos maduros y completamente desarrollados que son clones del organismo original (véase fragmentación reproductiva). La clonación de ADN también puede ser realizada intencionadamente por investigadores de laboratorio. En este caso, la fragmentación de ADN es una técnica genética molecular que permite a los investigadores utilizar la tecnología del ADN recombinante para preparar grandes cantidades de moléculas de ADN idénticas. Para que se complete la clonación de ADN, es necesario obtener regiones pequeñas y discretas del ADN de un organismo que constituyen genes específicos. Sólo se pueden clonar moléculas de ADN relativamente pequeñas en cualquier vector disponible. Por lo tanto, las largas moléculas de ADN que componen el genoma de un organismo deben escindirse en fragmentos que se puedan insertar en el ADN del vector. Dos enzimas facilitan la producción de dichas moléculas de ADN recombinante:

1. Restriction Enzymes

Las enzimas de restricción son endonucleas producidas por bacterias que típicamente reconocen pequeñas secuencias de pares base (llamados sitios de restricción) y luego acortan ambas cadenas de ADN en este sitio. Un sitio de restricción es típicamente una secuencia palindrómica, lo que significa que la secuencia de restricción-sitio es la misma en cada cadena de ADN cuando se lee en la dirección 5' a 3'.

Para cada enzima de restricción, las bacterias también producen una enzima de modificación para que el ADN de una bacteria anfitriona esté protegido del escote. Esto se hace modificando el ADN de host en o cerca de cada sitio de cobertura potencial. La enzima de modificación añade un grupo de metil a una o dos bases, y la presencia de este grupo de metil impide que la endonucleasa de restricción corte el ADN.

Muchas enzimas de restricción hacen cortes estancados en las dos cadenas de ADN en su sitio de reconocimiento, que genera fragmentos con una sola "talla" hebrada que supera en ambos extremos, llamada un extremo pegajoso. Las enzimas de restricción también pueden hacer cortes rectos en las dos cadenas de ADN en su sitio de reconocimiento, que genera extremos contundentes.

2. ligas de ADN

Durante la replicación normal del ADN, el ligasón de ADN cataliza la unión de extremo a extremo (ligación) de fragmentos cortos de ADN, llamados fragmentos de Okazaki. Para los propósitos de la clonación de ADN, ligase de ADN purificado se utiliza para unir covalentemente los extremos de un fragmento de restricción y ADN vectorial que tienen fines complementarios. Están ligados covalentemente a través de los vínculos estándar de 3' a 5' de fósforo del ADN.

El ligasón de ADN puede ligar extremos pegajosos y contundentes complementarios, pero la ligadura de extremos contundentes es ineficiente y requiere una mayor concentración tanto de ADN como de ligas de ADN que la ligación de extremos pegajosos. Por esta razón, la mayoría de las enzimas de restricción utilizadas en la clonación de ADN hacen cortes estancados en las cadenas de ADN para crear extremos pegajosos.

La clave para clonar un fragmento de ADN es unirlo a una molécula de ADN vector que pueda replicarse dentro de una célula huésped. Después de introducir una única molécula de ADN recombinante (compuesta por un vector más un fragmento de ADN insertado) en una célula huésped, el ADN insertado puede replicarse junto con el vector, generando una gran cantidad de moléculas de ADN idénticas. El esquema básico para esto puede resumirse de la siguiente manera:

Vector + ADN Fragmento

↓

ADN recombinante

↓

Replicación de ADN recombinante dentro de la célula huésped

↓

Isolación, secuenciación y manipulación del fragmento de ADN purificado

Existen numerosas variaciones experimentales de este esquema, pero estos pasos son esenciales para la clonación de ADN en un laboratorio.

La apoptosis se refiere a la muerte de células mediante una forma específica de muerte celular programada, caracterizada por una secuencia bien definida de cambios morfológicos. La contracción celular y nuclear, la condensación y fragmentación de la cromatina, la formación de cuerpos apoptóticos y la fagocitosis por parte de células vecinas caracterizan los principales cambios morfológicos en el proceso de apoptosis. Los amplios cambios morfológicos y bioquímicos durante la apoptosis garantizan que las células moribundas dejen un impacto mínimo en las células y/o tejidos vecinos.

Los genes implicados en el control de la muerte celular codifican proteínas con tres funciones distintas:

• Las proteínas "Killer" son necesarias para que una célula comience el proceso apoptótico
• Las proteínas de "Destrucción" hacen cosas como digerir ADN en una célula moribunda
• Las proteínas "Engulfment" son necesarias para la faagocitosis de la célula moribunda por otra célula

La división del ADN cromosómico en fragmentos más pequeños es una parte integral y un sello bioquímico distintivo de la apoptosis. La apoptosis implica la activación de endonucleasas con la división posterior del ADN de la cromatina en fragmentos de 180 pares de bases o múltiplos de 180 pares de bases (p. ej., 360, 540). Este patrón de fragmentación se puede utilizar para detectar la apoptosis en pruebas como un ensayo de encadenamiento de ADN con electroforesis en gel, un ensayo TUNEL o un ensayo de Nicoletti. La fragmentación del ADN apoptótico depende de una enzima llamada ADNasa activada por caspasa (CAD). La CAD suele ser inhibida por otra proteína en la célula, llamada inhibidor de la ADNasa activada por caspasa (ICAD). Para que comience la apoptosis, una enzima llamada caspasa 3 divide la ICAD de modo que la CAD se activa. Luego, la CAD corta el ADN entre los nucleosomas, que se encuentran en la cromatina a intervalos de 180 pares de bases. Los sitios entre los nucleosomas son las únicas partes del ADN que están expuestas y son accesibles a la CAD.

La fragmentación del ADN puede ocurrir en determinadas condiciones en algunos tipos de células diferentes. Esto puede provocar problemas en una célula o hacer que reciba una señal para que se someta a apoptosis. A continuación, se muestran un par de ejemplos de fragmentación irregular que puede ocurrir en las células.

1. Frabricación de glóbulos rojos

Un glóbulo rojo fragmentado es conocido como un esquistocito y es generalmente el resultado de una lesión mecánica intracelular a la célula sanguínea roja. Se puede observar una amplia variedad de esquistocitos. Los Schistocytes se ven generalmente en números relativamente bajos y se asocian con condiciones en las que el revestimiento endotelial normalmente liso, o endotelio, es rugido o irregular, y/o el lumen vascular es cruzado por hilos de fibrina. Los Schistocytes se ven comúnmente en pacientes que tienen anemia hemolítica. También son una característica de anemia por deficiencia de hierro avanzada, pero en este caso la fragmentación observada es probablemente el resultado de la fragilidad de las células producidas bajo estas condiciones.

2. fragmentación de ADN de células madre

En un macho promedio, menos del 4% de sus células de espermatozoides contendrán ADN fragmentado. Sin embargo, participar en comportamientos como fumar puede aumentar significativamente la fragmentación de ADN en células de esperma. Existe una correlación negativa entre el porcentaje de fragmentación de ADN y la motilidad, morfología y concentración de espermatozoides. También hay una asociación negativa entre el porcentaje de espermatozoides que contienen ADN fragmentado y la tasa de fertilización y la tasa de escisión embrionaria.