Fosfatasa alcalina

La enzima alkaline fosfatase (ALP, fosfatasa de alcalina) es una fosfatasa con el papel fisiológico de los compuestos desfosforiladores. La enzima se encuentra a través de una multitud de organismos, procariotas y eucariotas por igual, con la misma función general, pero en diferentes formas estructurales adecuadas al ambiente en que funcionan. La fosfatasa alcalina se encuentra en el espacio periplasmático E. coli bacterias. Esta enzima es estable de calor y tiene su actividad máxima en pH alto. En los seres humanos, se encuentra en muchas formas dependiendo de su origen dentro del cuerpo – juega un papel integral en el metabolismo dentro del hígado y el desarrollo dentro del esqueleto. Debido a su prevalencia generalizada en estas áreas, su concentración en el torrente sanguíneo es utilizada por los diagnósticos como biomarcador para ayudar a determinar diagnósticos como hepatitis o osteomalacia.

El nivel de fosfatasa alcalina en la sangre se controla mediante la prueba ALP, que suele formar parte de los análisis de sangre de rutina. Los niveles de esta enzima en la sangre dependen de factores como la edad, el sexo o el tipo de sangre. Los niveles de fosfatasa alcalina en la sangre también aumentan de dos a cuatro veces durante el embarazo. Esto es el resultado de la fosfatasa alcalina adicional producida por la placenta y el hígado. Además, los niveles anormales de fosfatasa alcalina en la sangre podrían indicar problemas relacionados con el hígado, la vesícula biliar o los huesos. Los tumores y las infecciones renales, así como la desnutrición, también han mostrado niveles anormales de fosfatasa alcalina en la sangre. Los niveles de fosfatasa alcalina en una célula se pueden medir mediante un proceso llamado "método de puntuación". Por lo general, se toma un frotis de sangre y se tiñe para categorizar cada leucocito en "índices de fosfatasa alcalina leucocítica" específicos. Este marcador está diseñado para distinguir los leucocitos y determinar la actividad enzimática diferente según el grado de tinción de cada muestra.

Bacterial

En las bacterias gramnegativas, como Escherichia coli, la fosfatasa alcalina se encuentra en el espacio periplásmico, fuera de la membrana celular interna y dentro de la porción de peptidoglicano de la pared celular. Dado que el espacio periplásmico es más propenso a la variación ambiental que la célula interna, la fosfatasa alcalina es adecuadamente resistente a la inactivación, la desnaturalización o la degradación. Esta característica de la enzima es poco común en muchas otras proteínas.

La estructura y función precisas de la isoenzima en E. coli están orientadas exclusivamente a proporcionar una fuente de fosfato inorgánico cuando el entorno carece de este metabolito. Los fosfatos inorgánicos se unen entonces a proteínas transportadoras que entregan los fosfatos inorgánicos a un sistema de transporte específico de alta afinidad, conocido como sistema de transporte específico de fosfato, que transporta el fosfato a través de la membrana citoplasmática.

Si bien la membrana externa de E. coli contiene porinas que son permeables a los compuestos fosforilados, la membrana interna no las contiene. Surge un problema en cómo transportar dichos compuestos a través de la membrana interna y hacia el citosol. La fuerte carga aniónica de los grupos fosfato junto con el resto del compuesto hace que los compuestos fosforilados sean muy inmiscibles en la región no polar de la bicapa. La solución surge al separar el grupo fosfato del compuesto a través de ALP para su translocación al citosol. El objetivo principal de la desfosforilación por fosfatasa alcalina es aumentar la velocidad de difusión de las moléculas fosforiladas hacia el interior de las células, al tiempo que se inhibe su difusión hacia el exterior.

La fosfatasa alcalina es una enzima dimérica que contiene zinc con un peso molecular de 86 000 Da, cada subunidad contiene 429 aminoácidos con cuatro residuos de cisteína que unen las dos subunidades. La fosfatasa alcalina contiene cuatro iones Zn y dos iones Mg, con Zn ocupando los sitios activos A y B, y Mg ocupando el sitio C, por lo que la fosfatasa alcalina nativa completamente activa se denomina enzima (Zn_AZn_BMg_C)₂. El mecanismo de acción de la fosfatasa alcalina implica la coordinación geométrica del sustrato entre los iones Zn en los sitios activos.

La fosfatasa alcalina en E. coli es excepcionalmente soluble y activa en condiciones de temperatura elevada, como 80 °C. Debido a la energía cinética inducida por esta temperatura, los enlaces de hidrógeno débiles y las interacciones hidrofóbicas de las proteínas comunes se degradan y, por lo tanto, se fusionan y precipitan. Sin embargo, tras la dimerización de la fosfatasa alcalina, los enlaces que mantienen sus estructuras secundaria y terciaria quedan enterrados de manera efectiva, de modo que no se ven tan afectados a esta temperatura. Además, incluso a temperaturas más elevadas, como 90 °C, la fosfatasa alcalina tiene la característica inusual de la desnaturalización inversa. Debido a esto, aunque finalmente se desnaturaliza a aproximadamente 90 °C, tiene la capacidad adicional de reformar con precisión sus enlaces y volver a su estructura y función originales una vez que se enfría nuevamente.

La fosfatasa alcalina en E. coli se encuentra en el espacio periplásmico y, por lo tanto, se puede liberar utilizando técnicas que debilitan la pared celular y liberan la proteína. Debido a la ubicación de la enzima y la disposición de la proteína de la enzima, la enzima está en solución con una cantidad menor de proteínas que en otra parte de la célula. La estabilidad térmica de las proteínas también se puede aprovechar al aislar esta enzima (a través de la desnaturalización por calor). Además, la fosfatasa alcalina se puede analizar utilizando fosfato de p-nitrofenilo. Una reacción en la que la fosfatasa alcalina desfosforila el sustrato no específico, fosfato de p-nitrofenilo, para producir p-nitrofenol (PNP) y fosfato inorgánico. El color amarillo del PNP y su λ_máx a 410 permiten que la espectrofotometría determine la actividad enzimática. Algunas complejidades de la regulación y el metabolismo bacteriano sugieren que otras funciones más sutiles de la enzima también pueden desempeñar un papel en la célula. Sin embargo, en el laboratorio, las Escherichia coli mutantes que carecen de fosfatasa alcalina sobreviven bastante bien, al igual que los mutantes incapaces de detener la producción de fosfatasa alcalina.

El pH óptimo para la actividad de la enzima de E. coli es 8,0, mientras que el pH óptimo de la enzima bovina es ligeramente superior, 8,5. La fosfatasa alcalina representa el 6% de todas las proteínas en las células desreprimidas.

Fosfatasa alcalina heterodímera

Cuando varias copias de un polipéptido codificado por un gen forman un agregado, esta estructura proteica se denomina multímero. Cuando un multímero se forma a partir de polipéptidos producidos por dos alelos mutantes diferentes de un gen en particular, el multímero mixto puede exhibir una mayor actividad funcional que los multímeros no mezclados formados por cada uno de los mutantes por separado. En tal caso, el fenómeno se denomina complementación intragénica. La fosfatasa alcalina de E. coli, una enzima dímera, exhibe complementación intragénica.

Uso en investigación

Al cambiar los aminoácidos de la enzima fosfatasa alcalina de tipo salvaje producida por Escherichia coli, se crea una fosfatasa alcalina mutante que no solo tiene un aumento de 36 veces en la actividad enzimática, sino que también conserva la estabilidad térmica. Los usos típicos en el laboratorio para las fosfatasas alcalinas incluyen la eliminación de monoésteres de fosfato para evitar la autoligación, lo cual es indeseable durante la clonación de ADN plasmídico.

Las fosfatasas alcalinas comunes que se utilizan en la investigación incluyen:

• Fosfatasa alcalina de camarón (SAP), de una especie de camarones árticos (Pandalus borealis). Esta fosfatasa se inactiva fácilmente arriendo la temperatura, una característica útil en algunas aplicaciones.
• La fosfatasa alcalina calfintestinal (CIP) típicamente útil en la clonación molecular, donde el ADN se somete a recombinación y no se hace ADN nuevo. Además, es útil en la desintoxicación mediada lipopolysaccharide respuestas inflamatorias así un medicamento para la enfermedad mediada de lipopolysaccharide.
• Fosfatasa alcalina placental (PLAP) y su versión truncada terminal C que carece de los últimos 24 aminoácidos (constituyendo el dominio que apunta al anclaje de membrana GPI) – la fosfatasa alcalina secreta (SEAP). Presenta ciertas características como la estabilidad del calor, especificidad del sustrato y resistencia a la inactivación química.
• Fosfatasa alcalina humano-intestinal. El cuerpo humano tiene múltiples tipos de fosfatasa alcalina presente, que se determinan por un mínimo de tres loci gen. Cada uno de estos tres loci controla un tipo diferente de isozima de fosfatasa alcalina. Sin embargo, el desarrollo de esta enzima se puede regular estrictamente por otros factores como la termostabilidad, electroforesis, inhibición o inmunología.

La fosfatasa alcalina intestinal humana muestra una homología de alrededor del 80% con la enzima intestinal bovina, lo que confirma que comparten su origen evolutivo. Esa misma enzima bovina tiene más del 70% de homología con la enzima placentaria humana. Sin embargo, la enzima hepática humana y la enzima placentaria solo comparten un 20% de homología a pesar de sus similitudes estructurales.

La fosfatasa alcalina se ha convertido en una herramienta útil en los laboratorios de biología molecular, ya que el ADN normalmente posee grupos fosfato en el extremo 5'. La eliminación de estos fosfatos evita que el ADN se ligue (el extremo 5' se una al extremo 3'), manteniendo así las moléculas de ADN lineales hasta el siguiente paso del proceso para el que se están preparando; además, la eliminación de los grupos fosfato permite el radiomarcaje (reemplazo por grupos fosfato radiactivos) para medir la presencia del ADN marcado a través de pasos posteriores en el proceso o experimento. Para estos fines, la fosfatasa alcalina del camarón es la más útil, ya que es la más fácil de inactivar una vez que ha hecho su trabajo.

Otro uso importante de la fosfatasa alcalina es como marcador para inmunoensayos enzimáticos debido a la elevada actividad catalítica de la enzima ALP.

Las células madre pluripotentes indiferenciadas tienen niveles elevados de fosfatasa alcalina en su membrana celular, por lo que la tinción con fosfatasa alcalina se utiliza para detectar estas células y evaluar la pluripotencia (es decir, células madre embrionarias o células de carcinoma embrionario).

Existe una correlación positiva entre los niveles séricos de fosfatasa alcalina ósea (BAP) y la formación ósea en humanos, aunque no se recomienda su uso como biomarcador en la práctica clínica.

Industria láctea

La fosfatasa alcalina se utiliza comúnmente en la industria láctea como indicador de una pasteurización exitosa. Esto se debe a que la bacteria más estable al calor que se encuentra en la leche, Mycobacterium paratuberculosis, se destruye a temperaturas inferiores a las requeridas para desnaturalizar la enzima. Por lo tanto, su presencia es ideal para indicar una pasteurización fallida.

La verificación de la pasteurización se realiza normalmente midiendo la fluorescencia de una solución que se vuelve fluorescente cuando se expone a la fosfatasa alcalina activa. Los productores de leche del Reino Unido exigen ensayos de fluorimetría para demostrar que la fosfatasa alcalina se ha desnaturalizado, ya que las pruebas de p-nitrofenilfosfato no se consideran lo suficientemente precisas para cumplir con los estándares sanitarios.

Alternativamente, se puede utilizar el cambio de color del p-nitrofenilfosfato como sustrato en una solución tamponada (prueba de Aschaffenburg Mullen). La leche cruda normalmente produce una coloración amarilla en un par de minutos, mientras que la leche pasteurizada correctamente no debería mostrar ningún cambio. Existen excepciones a esto, como en el caso de las fosfatasas alcalinas termoestables producidas por algunas bacterias, pero estas bacterias no deberían estar presentes en la leche.

Además, la prueba rápida de fosfatasa de Scharer investiga la presencia y la ausencia de enzimas ALP en la leche cruda. Esta prueba es ventajosa ya que una pasteurización completa inactiva las enzimas ALP, lo que no produce ningún cambio de color. Sin embargo, los resultados positivos de la prueba hacen que el color de la leche cruda cambie a azul, lo que indica la presencia de enzimas ALP. La prueba funciona separando un grupo fosfato del sustrato fenilfosfato disódico, lo que provoca la liberación de un grupo fenol e indica resultados positivos de la prueba observados visualmente y mediante un espectrofotómetro.

Inhibidores

Todas las isoenzimas de la fosfatasa alcalina de los mamíferos, excepto la placentaria (PALP y SEAP), son inhibidas por la homoarginina y, de manera similar, todas, excepto las intestinales y placentarias, son bloqueadas por el levamisol. El fosfato es otro inhibidor que inhibe competitivamente a la fosfatasa alcalina.

Otro ejemplo conocido de un inhibidor de fosfatasa alcalina es [(4-Nitrophenyl)metil]ácido fosfónico.

En suelos contaminados con metales, la fosfatasa alcalina es inhibida por el Cd (cadmio). Además, la temperatura aumenta la inhibición del Cd sobre la actividad enzimática, lo que se refleja en el aumento de los valores de K_m.

Humano

Fisiología

En los seres humanos, la fosfatasa alcalina está presente en todos los tejidos del cuerpo, pero se concentra especialmente en el hígado, el conducto biliar, el riñón, los huesos, la mucosa intestinal y la placenta. En el suero predominan dos tipos de isoenzimas de fosfatasa alcalina: la esquelética y la hepática. Durante la infancia, la mayoría de las fosfatasas alcalinas son de origen esquelético. Los seres humanos y la mayoría de los demás mamíferos contienen las siguientes isoenzimas de fosfatasa alcalina:

• ALPI – intestinal (masa molecular de 150 kDa)
• ALPL – tejido no específico (expresado principalmente en hígado, hueso y riñón)
• ALPP – placental (Regan isozyme)
• ALPG – tejidos germinales

Cuatro genes codifican las cuatro isoenzimas. El gen de la fosfatasa alcalina no específica de tejido se encuentra en el cromosoma 1, y los genes de las otras tres isoformas se encuentran en el cromosoma 2.

La fosfatasa alcalina intestinal es secretada por los enterocitos y parece desempeñar un papel fundamental en la homeostasis y la protección intestinal, así como en la supresión de la inflamación a través de la represión de la cascada inflamatoria dependiente del receptor tipo Toll (TLR)-4 y de MyD88. Desfosforila ligandos microbianos tóxicos/inflamatorios como lipopolisacáridos (LPS), dinucleótidos de citosina-guanina no metilados, flagelina y nucleótidos extracelulares como el difosfato de uridina o el ATP. La desfosforilación de LPS por IAP puede reducir la gravedad de la infección por Salmonella tryphimurium y Clostridioides difficile, restaurando la microbiota intestinal normal. Por lo tanto, la expresión alterada de IAP se ha relacionado con enfermedades inflamatorias crónicas como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). También parece regular la absorción de lípidos y la secreción de bicarbonato en la mucosa duodenal, que regula el pH de la superficie. Desde la década de 1960, la fosfatasa alcalina intestinal se ha utilizado en la administración de fármacos. Dado que escinde las subestructuras de fosfato de los fármacos, los agentes auxiliares e incluso de la superficie de los nanotransportadores, esta enzima permite el diseño de sistemas de administración de fármacos que pueden alterar sus propiedades en el cuerpo según la demanda. La solubilidad de muchos fármacos se puede mejorar sustancialmente mediante el diseño de profármacos de fosfato. En la mucosa intestinal, la fosfatasa alcalina escinde las subestructuras de fosfato y el fármaco se absorbe. Además, los nanotransportadores aniónicos que presentan propiedades bioinertes pueden alterar su superficie para que sea interactiva una vez que han alcanzado el epitelio intestinal, ya que debido a una escisión desencadenada por la fosfatasa alcalina de los grupos de fosfato aniónicos de su carga superficial se convierte en catiónicos, lo que mejora, por ejemplo, la captación celular.

En las células cancerosas

Los estudios muestran que la proteína fosfatasa alcalina que se encuentra en las células cancerosas es similar a la que se encuentra en los tejidos corporales no malignos y que la proteína se origina del mismo gen en ambos. Un estudio comparó las enzimas de las metástasis hepáticas del carcinoma pulmonar de células gigantes y las células placentarias no malignas. Las dos eran similares en cuanto a la secuencia terminal NH2, el mapa de péptidos, el peso molecular de las subunidades y el punto isoelectrónico.

En otro estudio en el que los científicos examinaron la presencia de la proteína fosfatasa alcalina en una línea celular de cáncer de colon humano, también conocida como HT-29, los resultados mostraron que la actividad de la enzima era similar a la del tipo intestinal no maligno. Sin embargo, este estudio reveló que sin la influencia del butirato de sodio, la actividad de la fosfatasa alcalina es bastante baja en las células cancerosas. Un estudio basado en los efectos del butirato de sodio en las células cancerosas transmite que tiene un efecto sobre la expresión del corregulador del receptor de andrógenos, la actividad de transcripción y también sobre la acetilación de histonas en las células cancerosas. Esto explica por qué la adición de butirato de sodio muestra una mayor actividad de la fosfatasa alcalina en las células cancerosas del colon humano. Además, esto respalda aún más la teoría de que la actividad de la enzima fosfatasa alcalina está realmente presente en las células cancerosas.

En otro estudio, se cultivaron células de coriocarcinoma en presencia de 5-bromo-2'-desoxiuridina y los resultados mostraron un aumento de 30 a 40 veces en la actividad de la fosfatasa alcalina. Este procedimiento de aumento de la actividad de la enzima se conoce como inducción enzimática. La evidencia muestra que, de hecho, hay actividad de la fosfatasa alcalina en las células tumorales, pero es mínima y necesita ser aumentada. Los resultados de este estudio indican además que las actividades de esta enzima varían entre las diferentes líneas celulares de coriocarcinoma y que la actividad de la proteína fosfatasa alcalina en estas células es menor que en las células de placenta no malignas, pero los niveles son significativamente más altos en niños y mujeres embarazadas. Los análisis de sangre siempre deben interpretarse utilizando el rango de referencia del laboratorio que realizó la prueba. Pueden producirse niveles altos de fosfatasa alcalina si los conductos biliares están obstruidos.

Además, el nivel de fosfatasa alcalina aumenta si hay una formación ósea activa, ya que la enzima es un subproducto de la actividad de los osteoblastos (como en el caso de la enfermedad ósea de Paget).

El nivel de fosfatasa alcalina es mucho más elevado en las células de cáncer de próstata metastásico que en las células de cáncer de próstata no metastásico. Los niveles elevados de fosfatasa alcalina en pacientes con cáncer de próstata se asocian con una disminución significativa de la supervivencia.

Los niveles también están elevados en personas con enfermedad celíaca no tratada. Los niveles bajos de fosfatasa alcalina son menos comunes que los niveles elevados. La fuente de los niveles elevados se puede deducir obteniendo los niveles séricos de γ-glutamiltransferasa. Los aumentos concomitantes de fosfatasa alcalina con γ-glutamiltransferasa deben hacer sospechar una enfermedad hepatobiliar.

Algunas enfermedades no afectan los niveles de fosfatasa alcalina, por ejemplo, la hepatitis C. Un nivel alto de esta enzima no refleja ningún daño en el hígado, aunque los niveles altos de fosfatasa alcalina pueden ser resultado de un bloqueo del flujo en el tracto biliar o un aumento en la presión del hígado.

Niveles elevados

A partir de 2020, los niveles normales de fosfatasa alcalina (FA) "no estaban bien definidos" y tienden a existir variaciones según el sexo y el origen racial, así como según la edad, y los niños y adolescentes presentan niveles marcadamente más altos.

Existen muchas explicaciones posibles para la fosfatasa alcalina elevada. Cuando la causa no está clara, los estudios de isoenzimas mediante electroforesis pueden confirmar la fuente del aumento. La fosfatasa alcalina placentaria (que se localiza en los osteoblastos y las capas extracelulares de la matriz recién sintetizada) se libera a la circulación mediante un mecanismo aún no aclarado. La fosfatasa alcalina placentaria está elevada en los seminomas y las formas activas del raquitismo, así como en las siguientes enfermedades y afecciones:

• Obstrucción humillante
• Condiciones de bonificación
• Tumores ósteoblásticos del hueso
• Osteomalacia
• Osteoporosis
• Hepatitis
• Mononucleosis
• Cirrosis
• Colecistitis aguda
• Mielofibrosis
• Reacción de Leukemoid
• Insuficiencia cardíaca congestiva
• Linfoma
• Enfermedad de Paget
• Sarcoidosis
• Hipertiroidismo
• Hiperparatiroidismo
• Infarto de miocardio
• Cholangitis
• Colangiopatía isquémica
• Embarazo
• Dosis altas de estrógenos

Niveles reducidos

Las siguientes afecciones o enfermedades pueden provocar niveles reducidos de fosfatasa alcalina:

• Hipofosfatasia, un trastorno genético
• Las mujeres que reciben tratamiento de estrógeno para síntomas menopáusicos
• Anticonceptivos orales que contienen estrógeno
• Hombres con cirugía cardíaca reciente, malnutrición, deficiencia de magnesio o anemia grave
• Niños con acondroplasia y deficiencia de yodo congénita
• Niños después de un episodio severo de enteritis
• anemia perniciosa
• Anemia aplásica
• La enfermedad de Wilson
• Hipotiroidismo
• Deficiencia de zinc
• Malnutrición
• Tratamiento de esteroides
• Colitis
• Enfermedad tiroidea

Usos pronósticos

Se ha demostrado que la medición de la fosfatasa alcalina (junto con el antígeno prostático específico) durante y después de seis meses de tratamiento hormonal para el cáncer de próstata metastásico predice la supervivencia de los pacientes.

Fosfatasa alcalina leucocitaria

La fosfatasa alcalina leucocítica se encuentra en los glóbulos blancos maduros. Los niveles de fosfatasa alcalina leucocítica en los glóbulos blancos pueden ayudar en el diagnóstico de ciertas enfermedades.

• Los niveles más altos que los típicos se ven en la respuesta fisiológica, la reacción leucoemoide, y en patologías que incluyen glóbulos blancos maduros, como la policitemia vera, trombocitosis esencial, y en la mielofibrosis primaria.
• Los niveles inferiores a los típicos se encuentran en patologías que implican leucocitos no desarrollados, como la leucemia mielógena crónica (CML), hemoglobinuria nocturna paroxismal y leucemia mielógena aguda.

Estructura y propiedades

La fosfatasa alcalina es una enzima homodímera, lo que significa que está formada por dos moléculas. Tres iones metálicos, dos Zn y uno Mg, están contenidos en los sitios catalíticos, y ambos tipos son cruciales para que se produzca la actividad enzimática. Las enzimas catalizan la hidrólisis de monoésteres en ácido fosfórico, que puede catalizar además una reacción de transfosforilación con grandes concentraciones de aceptores de fosfato. Si bien las principales características del mecanismo catalítico y la actividad se conservan entre el fosfato alcalino de mamíferos y bacterias, la fosfatasa alcalina de mamíferos tiene una actividad específica y valores de K_m más altos, por lo tanto, una afinidad menor, un pH óptimo más alcalino, una estabilidad térmica menor y, por lo general, están unidas a la membrana y son inhibidas por l-aminoácidos y péptidos a través de un mecanismo no competitivo. Estas propiedades difieren notablemente entre las diferentes isoenzimas de la fosfatasa alcalina de mamíferos y, por lo tanto, muestran una diferencia en las funciones in vivo.

La fosfatasa alcalina tiene homología con una gran cantidad de otras enzimas y forma parte de una superfamilia de enzimas con varios aspectos catalíticos y rasgos de sustrato superpuestos. Esto explica por qué las características estructurales más destacadas de las fosfatasas alcalinas de los mamíferos son las que son y hacen referencia a su especificidad de sustrato y homología con otros miembros de la familia de isoenzimas nucleósido pirofosfatasa/fosfodiesterasa. Las investigaciones han demostrado una relación entre los miembros de la familia de las fosfatasas alcalinas y las arilsulfatasas. Las similitudes en la estructura indican que estas dos familias de enzimas provienen de un ancestro común. Análisis posteriores han vinculado los fosfatos alcalinos y las arilsulfatasas a una superfamilia más grande. Algunos de los genes comunes encontrados en esta superfamilia son los que codifican fosfodiesterasas y autotoxinas.