Formazán

Los formazanos son compuestos de fórmula general [R-N=N-C(R')=N-NH-R"], formalmente derivados del formazán [H₂NN=CHN=NH], desconocido en forma libre.

Los colorantes de formazán son productos cromogénicos artificiales obtenidos por reducción de las sales de tetrazolio por deshidrogenasas y reductasas. Tienen una variedad de colores que van desde el azul oscuro hasta el rojo intenso y el naranja, dependiendo de la sal de tetrazolio original utilizada como sustrato para la reacción.

Los formazanos son compuestos intensamente coloridos que se caracterizan por la siguiente estructura: [-N=N-C(R)=N-NH-], y están estrechamente relacionados con los colorantes azoicos (−N=N−). Su estructura fue definida por primera vez en 1892 por von Pechmann y por Bamberger y Wheelwright de forma independiente. Su color intenso y su química redox se derivan de su estructura principal rica en nitrógeno.

Los formazanos tienen una gran flexibilidad tautomérica y conformacional. Debido a los dos enlaces dobles alternados en la cadena principal, los formazanos pueden existir en cuatro formas isoméricas posibles: syn, s-cis (forma cerrada); syn, s-trans (forma abierta); anti, s-cis; y anti, s-trans (forma lineal).

Los formazanos 1,5-disustituidos pueden existir como dos tautómeros (1 y 2 en la imagen de abajo). Tras la desprotonación, el anión formado (3) se estabiliza por resonancia. Con los iones de metales de transición (Cu2+, Co3+, Ni2+, Zn2+, etc.), los formazanos forman complejos muy coloreados (quelatos).

Debido a su capacidad de reaccionar tanto con ácidos como con bases fuertes, los formazanos pueden considerarse anfóteros.

La oxidación de estos compuestos da como resultado su conversión en sales de tetrazolio incoloras. Entre los diversos oxidantes utilizados se encuentran el óxido de mercurio, el ácido nítrico, el nitrito de isoamilo, la N-bromosuccinimida, el permanganato de potasio, el tetraacetato de plomo y el hipoclorito de t-butilo. Dependiendo de las condiciones, las sales de tetrazolio pueden reducirse para formar radicales tetrazolilo o formazán:

Existen varios métodos sintéticos para la síntesis de formazanos.

La reacción de los compuestos de diazonio con hidrazonas de aldehído es uno de los procedimientos más comunes para producir formazanos. Las hidrazonas, que son compuestos ricos en electrones, reaccionan con sales de diazonio en un átomo de nitrógeno o de carbono para producir formazanos. Las sales de diazonio se acoplan al nitrógeno de la amina en la hidrazona con el desplazamiento de un hidrógeno para dar el intermedio, que luego se reorganiza en formazano.

Otra forma de sintetizar formazanos es mediante la reacción de compuestos de metileno activos con sales de diazonio. Las sales de diazonio se añaden a los compuestos de metileno activos para formar un compuesto azo intermedio, seguido de la adición de una segunda sal de diazonio (en condiciones más alcalinas), lo que produce tetrazeno, que luego forma un formazano 3-sustituido.

Los formazanos también pueden producirse por oxidación de las hidrazidinas correspondientes, que normalmente se preparan mediante la reacción de haluros de hidrazonilo con los derivados de hidrazina apropiados. Por ejemplo, el formiato de etilo o el ortoformiato reaccionan con dos equivalentes de fenilhidrazina para producir 1,5-difenilformazán, en condiciones ácidas. En condiciones básicas, el nitrato de etilo reacciona en la posición metileno para producir 3-metil-1,5-difenilformazán, que también puede obtenerse a partir de la reacción de fenilazoetano con nitrito de isoamilo.

Además, los formazanos pueden obtenerse por descomposición de sales de tetrazolio sustituidas, ya sea fotoquímicamente o bajo la influencia del ácido ascórbico en un medio alcalino.

Las sales de tetrazolio y sus productos derivados del formazán se utilizan ampliamente en métodos histoquímicos, especialmente en ensayos de viabilidad colorimétrica. Estos procedimientos se basan en la reducción del tetrazolio por las enzimas deshidrogenasas mitocondriales, que se encuentran en el interior de las células vivas:

Entre los principales ejemplos de las sales de tetrazolio más utilizadas se incluyen:

1. INT o 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-fenyl-2H-tetrazolium chloride, which is water-insoluble.
2. MTT o 3-(4,5-dimetil-2-thiazolyl)-2, 5-difenil-2H-tetrazolium bromide, que es insoluble en agua y utilizado en el ensayo MTT.
3. XTT o 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide, que es soluble en agua.
4. MTS o 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymetoxiphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, que es soluble en agua y utilizado en el ensayo MTS.
5. Cloruro de TTC o tetrazolium o cloruro de 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium, que es soluble en agua.
6. NBT utilizado en una prueba diagnóstica, especialmente para la enfermedad granulomatosa crónica y otras enfermedades de la función de la fagocito.

Cuando se reduce en una célula, ya sea enzimáticamente o a través de una reacción directa con NADH o NADPH, la sal clásica de tetrazolio, MTT, se torna de azul a violeta y puede formar un precipitado insoluble. Estos colorantes de formazán se utilizan comúnmente en ensayos de proliferación y toxicidad celular, como las pruebas EpiDerm y EpiSkin, ya que solo tiñen células vivas y metabólicamente activas.