Fluoróforo

Un fluoróforo (o fluorocromo, de manera similar a un cromóforo) es un compuesto químico fluorescente que puede reemitir luz tras la excitación de la luz. Los fluoróforos suelen contener varios grupos aromáticos combinados, o moléculas planas o cíclicas con varios enlaces π.

Los fluoróforos a veces se utilizan solos, como trazadores en fluidos, como tinte para teñir determinadas estructuras, como sustrato de enzimas o como sonda o indicador (cuando su fluorescencia se ve afectada por aspectos ambientales como la polaridad o los iones).). De manera más general, están unidos covalentemente a una macromolécula y sirven como marcador (o colorante, etiqueta o indicador) para reactivos afines o bioactivos (anticuerpos, péptidos, ácidos nucleicos). Los fluoróforos se utilizan especialmente para teñir tejidos, células o materiales en una variedad de métodos analíticos, es decir, imágenes fluorescentes y espectroscopia.

La fluoresceína, a través de su isotiocianato de fluoresceína (FITC), derivado isotiocianato reactivo con aminas, ha sido uno de los fluoróforos más populares. Del marcaje de anticuerpos, las aplicaciones se han extendido a los ácidos nucleicos gracias a la carboxifluoresceína (FAM), TET,...). Otros fluoróforos históricamente comunes son los derivados de rodamina (TRITC), cumarina y cianina. Las nuevas generaciones de fluoróforos, muchos de los cuales son patentados, a menudo funcionan mejor, siendo más fotoestables, más brillantes y/o menos sensibles al pH que los tintes tradicionales con excitación y emisión comparables.

Fluorescencia

El fluoróforo absorbe energía luminosa de una longitud de onda específica y reemite luz en una longitud de onda más larga. Las longitudes de onda absorbidas, la eficiencia de la transferencia de energía y el tiempo antes de la emisión dependen tanto de la estructura del fluoróforo como de su entorno químico, ya que la molécula en su estado excitado interactúa con las moléculas circundantes. Las longitudes de onda de máxima absorción (≈ excitación) y emisión (por ejemplo, Absorción/Emisión = 485 nm/517 nm) son los términos típicos utilizados para referirse a un fluoróforo determinado, pero puede ser importante considerar todo el espectro. El espectro de longitudes de onda de excitación puede ser una banda muy estrecha o más amplia, o puede estar por encima de un nivel de corte. El espectro de emisión suele ser más nítido que el espectro de excitación, tiene una longitud de onda más larga y, en consecuencia, una energía más baja. Las energías de excitación varían desde el ultravioleta hasta el espectro visible, y las energías de emisión pueden continuar desde la luz visible hasta la región del infrarrojo cercano.

Las principales características de los fluoróforos son:

• Potenciación máxima y longitud de onda de emisión (expresado en nanometros (nm)): corresponde al pico en el espectro de excitación y emisión (generalmente un pico cada uno).
• Coeficiente de absorción de molares (en Molar⁻¹cm⁻¹): vincula la cantidad de luz absorbida, a una longitud de onda determinada, a la concentración de fluoróforo en solución.
• Rendimiento cuántico: eficiencia de la energía transferida de la luz del incidente a fluorescencia emitida (= número de fotones emitidos por fotones absorbidos).
• Vida (en picosegundos): duración del estado excitado de un fluoróforo antes de regresar a su estado del suelo. Se refiere al tiempo que se toma para una población de fluoróforos excitados para desintegrarse a 1/e (Ω0.368) de la cantidad original.
• Cambio de estómagos: diferencia entre la máxima excitación y longitudes de onda máximas de emisión.
• Fracción oscura: proporción de las moléculas activas en la emisión de fluorescencia. Para puntos cuánticos, la microscopía prolongada de un solo molécula mostró que el 20-90% de todas las partículas nunca emiten fluorescencia. Por otro lado, las nanopartículas polímeros conjugadas (Pdots) muestran casi ninguna fracción oscura en su fluorescencia. Las proteínas fluorescentes pueden tener una fracción oscura de la formación de cromoforo de proteínas o defectuosas.

Estas características impulsan otras propiedades, incluido el fotoblanqueo o la fotorresistencia (pérdida de fluorescencia tras la excitación de luz continua). Se deben considerar otros parámetros, ya que la polaridad de la molécula del fluoróforo, el tamaño y la forma del fluoróforo (es decir, el patrón de fluorescencia de polarización) y otros factores pueden cambiar el comportamiento de los fluoróforos.

Los fluoróforos también se pueden utilizar para apagar la fluorescencia de otros tintes fluorescentes (consulte el artículo Extinción (fluorescencia)) o para transmitir su fluorescencia a longitudes de onda aún más largas (consulte el artículo Transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET)).

Ver más sobre el principio de fluorescencia.

Tamaño (peso molecular)

La mayoría de los fluoróforos son pequeñas moléculas orgánicas de 20 a 100 átomos (200 a 1000 Dalton; el peso molecular puede ser mayor dependiendo de las modificaciones injertadas y las moléculas conjugadas), pero también hay fluoróforos naturales mucho más grandes que son proteínas: verde fluorescente La proteína (GFP) es de 27 kDa y varias ficobiliproteínas (PE, APC...) son de ≈240 kDa. En 2020, se afirmó que el fluoróforo más pequeño conocido era el 3-hidroxiisonicotinaldehído, un compuesto de 14 átomos y solo 123 Da.

Las partículas fluorescentes como los puntos cuánticos: de 2 a 10 nm de diámetro y de 100 a 100 000 átomos, también se consideran fluoróforos.

El tamaño del fluoróforo podría obstaculizar estéricamente la molécula marcada y afectar la polaridad de la fluorescencia.

Familias

Las moléculas de fluoróforo podrían utilizarse solas o servir como motivo fluorescente de un sistema funcional. Según la complejidad molecular y los métodos sintéticos, las moléculas de fluoróforo podrían clasificarse generalmente en cuatro categorías: proteínas y péptidos, pequeños compuestos orgánicos, oligómeros y polímeros sintéticos y sistemas de múltiples componentes.

Las proteínas fluorescentes GFP (verde), YFP (amarilla) y RFP (roja) se pueden unir a otras proteínas específicas para formar una proteína de fusión, sintetizada en células después de la transfección de un portador de plásmido adecuado.

no proteicos pertenecen a las siguientes familias químicas principales:

• Xanthene derivatives: fluoresceína, rodamina, Oregon verde, eosina y Texas rojo
• Derivados cianinos: cianina, indocarbociana, oxacarbociana, tiacarbociana y merocianina
• Derivados de escuadra y escuadras substituidas por anillo, incluyendo los tintes de Seta y Square
• Derivados rotativos escuaranos: See Tau dyes
• Derivados de naftalina (Ddansyl y derivados prodan)
• Derivados Coumarin
• Derivados oxadiazoles: pyridyloxazole, nitrobenzoxazole y benzoxadiazole
• Derivados antracitanos: antraquinones, incluyendo DRAQ5, DRAQ7 y CyTRAK Orange
• Pyrene derivatives: azul cascada, etc.
• Derivados de Oxazina: Nilo rojo, Azul Nilo, violeta de cresilo, oxazina 170, etc.
• Acridine derivatives: proflavin, acridina naranja, acridina amarilla, etc.
• Arylmethine derivatives: auramina, violeta de cristal, verde malachito
• Tetrapyrrole derivatives: porfin, phthalocyanine, bilirubin
• Dipyrromethene derivatives: BODIPY, aza-BODIPY

Estos fluoróforos emiten fluorescencia debido a electrones deslocalizados que pueden saltar una banda y estabilizar la energía absorbida. El benceno, uno de los hidrocarburos aromáticos más simples, por ejemplo, se excita a 254 nm y emite a 300 nm. Esto distingue los fluoróforos de los puntos cuánticos, que son nanopartículas semiconductoras fluorescentes.

Se pueden unir a proteínas a grupos funcionales específicos, como grupos amino (éster activo, carboxilato, isotiocianato, hidracina), grupos carboxilo (carbodiimida), tiol (maleimida, bromuro de acetilo), azida orgánica (mediante química de clic). o de forma no específica (glutaraldehído)).

Además, pueden estar presentes varios grupos funcionales para alterar sus propiedades, como la solubilidad, o conferir propiedades especiales, como el ácido borónico que se une a azúcares o múltiples grupos carboxilo para unirse a ciertos cationes. Cuando el tinte contiene un grupo donador de electrones y un grupo aceptor de electrones en los extremos opuestos del sistema aromático, este tinte probablemente será sensible a la polaridad del medio ambiente (solvatocrómico), por lo que se denomina sensible al medio ambiente. A menudo se utilizan colorantes en el interior de las células, que son impermeables a las moléculas cargadas, como resultado de esto los grupos carboxilo se convierten en un éster, que se elimina mediante esterasas dentro de las células, por ejemplo, fura-2AM y diacetato de fluoresceína.

Las siguientes familias de tintes son grupos de marcas registradas y no necesariamente comparten similitudes estructurales.

• Tinte CF (Biotium)
• Sondas DRAQ y CyTRAK (BioStatus)
• BODIPY (Invitrogen)
• EverFluor (Setareh Biotech)
• Alexa Fluor (Invitrógeno)
• Bella Fluor (Setareh Biotech)
• Fluor DyLight (Thermo Scientific, Pierce)
• Atto y Tracy (Sigma Aldrich)
• FluoProbes (Interchim)
• Abberior Dyes (Abberior)
• DY y MegaStokes Dyes (Dyomics)
• Sulfo Cy dyes (Cyandye)
• Fluor HiLyte (AnaSpec)
• Seta, Setau y Square Dyes (SETA BioMedicals)
• Tintes de Quasar y Cal Fluor (Biosearch Technologies)
• SureLight Dyes (APC, RPEPerCP, Phycobilisomes) (Columbia Biosciences)
• APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen)
• Vio Dyes (Miltenyi Biotec)

Ejemplos de fluoróforos que se encuentran con frecuencia

Colorantes reactivos y conjugados

Abreviaturas:

• Ex (nm): longitud de onda de excitación en nanometros
• Em (nm): longitud de onda de emisión en nanometros
• MW: Peso molecular
• QY: Rendimiento cuántico

Tintes de ácidos nucleicos

Tintes de función celular

Proteínas fluorescentes

Abreviaturas:

• Ex (nm): longitud de onda de excitación en nanometros
• Em (nm): longitud de onda de emisión en nanometros
• MW: Peso molecular
• QY: Rendimiento cuántico
• BR: Brillo: coeficiente de absorción de molares * rendimiento cuántico / 1000
• PS: Photostability: time [sec] to reduce brightness by 50%

Aplicaciones

Los fluoróforos tienen particular importancia en el campo de la bioquímica y los estudios de proteínas, por ejemplo, en inmunofluorescencia pero también en el análisis celular, por ejemplo. inmunohistoquímica y sensores de moléculas pequeñas.

Usos fuera de las ciencias biológicas

Además, los tintes fluorescentes encuentran un amplio uso en la industria, bajo el nombre de "colores neón", como por ejemplo:

• Usos de escala multiton en tintes textiles y brillos ópticos en detergentes de lavandería
• Formulaciones cosméticas avanzadas; equipo de seguridad y ropa
• Diódos orgánicos emisores de luz (OLED)
• Bellas artes y diseño (posteros y pinturas)
• Sinergistas para insecticidas y fármacos experimentales
• Como tinte en los resaltadores para dar un efecto de brillo
• Paneles solares para recoger más luz / longitudes de onda
• El tinte de mar fluorescente se utiliza para ayudar a los equipos de búsqueda y rescate aéreos a localizar objetos en el agua