Fenilalanina amoniaco liasa

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La enzima fenilalanina amonio liasa (EC 4.3.1.24) cataliza la conversión de L-fenilalanina en amoníaco y ácido transcinámico.
L-fenilalanina = trans-cinnamate + NH3
La fenilalanina amonio liasa (PAL) es el primer paso fundamental en la vía de los fenilpropanoides y, por lo tanto, participa en la biosíntesis de compuestos polifenólicos como flavonoides, fenilpropanoides y lignina en plantas. La fenilalanina amonio liasa se encuentra ampliamente distribuida en plantas, así como en algunas bacterias, levaduras y hongos, con isoenzimas presentes en muchas especies diferentes. Tiene una masa molecular de 270 a 330 kDa. La actividad de la PAL se induce drásticamente en respuesta a diversos estímulos, como heridas tisulares, ataques patógenos, luz, bajas temperaturas y hormonas. Recientemente se ha estudiado la PAL por sus posibles beneficios terapéuticos en humanos con fenilcetonuria. También se ha utilizado en la generación de L-fenilalanina, precursora del edulcorante aspartamo.La enzima pertenece a la familia de las amonialiasas, que rompen enlaces carbono-nitrógeno. Al igual que otras liasas, la PAL requiere solo un sustrato para la reacción directa, pero dos para la inversa. Se cree que su mecanismo es similar al de la enzima relacionada histidina amonialiasa (EC:4.3.1.3, HAL). El nombre sistemático de esta clase de enzimas es L-fenilalanina amonialiasa (formadora de transcinamato). Anteriormente, se designaba como EC 4.3.1.5, pero esta clase se ha rediseñado como EC 4.3.1.24 (fenilalanina amonialiasas), EC 4.3.1.25 (tirosina amonialiasas) y EC 4.3.1.26 (fenilalanina/tirosina amonialiasas). Otros nombres comunes incluyen tirasa, fenilalanina desaminasa, tirosina amoniaco liasa, L-tirosina amoniaco liasa, fenilalanina amonio liasa, PAL y L-fenilalanina amoniaco liasa.

Mecanismo

La fenilalanina amonio liasa es específica para la L-fenilalanina y, en menor medida, para la L-tirosina. La reacción catalizada por la PAL es una eliminación espontánea en lugar de una desaminación oxidativa.El cofactor 3,5-dihidro-5-metildieno-4H-imidazol-4-ona (MIO) participa en la reacción y se sitúa sobre el polo positivo de tres hélices polares en el sitio activo, lo que contribuye a aumentar su electrofilicidad. El MIO es atacado por el anillo aromático de L-phe, que activa el enlace C-H en el carbono β para su desprotonación por un residuo básico. El carbanión intermedio de esta reacción de eliminación de E1cB, estabilizado por regiones positivas parciales en el sitio activo, expulsa amoníaco para formar el alqueno cinamato. Se cree que el mecanismo de reacción de PAL es similar al de la enzima relacionada histidina amonio liasa.
Propuesta de formación autocatalítica del cofactor MIO del tripeptide Ala-Ser-Gly por dos pasos de eliminación del agua.
Durante mucho tiempo se consideró que un residuo de deshidroalanina era el residuo catalítico electrofílico clave en PAL y HAL, pero posteriormente se descubrió que el residuo activo era MIO, aún más electrofílico. Se forma por ciclización y deshidratación del segmento tripéptido Ala-Ser-Gly conservado. El primer paso en la formación de MIO es una ciclización-eliminación mediante un ataque nucleofílico intramolecular del nitrógeno de Gly₂O₄ en el grupo carbonilo de Ala₂O₄. Una posterior eliminación de agua de la cadena lateral de Ser₂O₄ completa el sistema de dobles enlaces conjugados cruzados. Se proporcionan los números de la fenilalanina amonio liasa de Petroselinum crispum (PDB 1W27). Aunque MIO es una modificación polipeptídica, se propuso denominarlo grupo prostético, debido a su propiedad de un compuesto orgánico añadido.La PAL es inhibida por el ácido transcinámico y, en algunas especies, puede ser inhibida por sus derivados. Los aminoácidos artificiales D-Phe y D-Tyr, las formas enantioméricas del sustrato normal, son inhibidores competitivos.

Estructura

Sitio activo de PAL
La fenilalanina amonio liasa se compone de cuatro subunidades idénticas, compuestas principalmente por hélices alfa, con pares de monómeros que forman un único sitio activo. La catálisis en PAL puede estar gobernada por los momentos dipolares de siete hélices alfa diferentes asociadas al sitio activo. El sitio activo contiene el grupo electrofílico MIO unido mediante enlaces no covalentes a tres hélices. Leu266, Asn270, Val269, Leu215, Lys486 e Ile472 se encuentran en las hélices del sitio activo, mientras que Phe413, Glu496 y Gln500 contribuyen a la estabilización del cofactor MIO. La orientación de los momentos dipolares generados por las hélices dentro del sitio activo genera una región electropositiva para una reactividad ideal con MIO. Las regiones parcialmente positivas en el sitio activo también pueden ayudar a estabilizar la carga de un carbanión intermedio. La PAL es estructuralmente similar a la histidina amonio liasa, con la que está relacionada mecánicamente, aunque tiene aproximadamente 215 residuos adicionales.

Función

La fenilalanina amonio liasa puede desempeñar diferentes funciones en distintas especies. Se encuentra principalmente en algunas plantas y hongos (p. ej., levaduras). En las células de hongos y levaduras, la PAL desempeña una importante función catabólica, generando carbono y nitrógeno. En las plantas, es una enzima biosintética clave que cataliza el primer paso en la síntesis de diversos compuestos polifenílicos y participa principalmente en los mecanismos de defensa. La PAL participa en cinco vías metabólicas: metabolismo de la tirosina, metabolismo de la fenilalanina, metabolismo del nitrógeno, biosíntesis de fenilpropanoides y biosíntesis de alcaloides.

Importancia de la enfermedad

Se está explorando la terapia de sustitución enzimática con PAL para tratar la fenilcetonuria (PKU), un trastorno genético autosómico recesivo en humanos en el que las mutaciones en el gen de la fenilalanina hidroxilasa (PAH, EC 1.14.16.1) inactivan la enzima. Esto provoca la incapacidad del paciente para metabolizar la fenilalanina, lo que provoca niveles elevados de Phe en sangre (hiperfenilalaninemia) y retraso mental si el tratamiento no se inicia al nacer.En mayo de 2018, la FDA aprobó la pegvaliasa, una fenilalanina amoniaco liasa pegilada recombinante para el tratamiento de la PKU, desarrollada por Biomarin.

En plantas

Vàsquez et al. (2017) investigaron Lactuca sativa. Descubrieron que el tratamiento con UV-C aumentó la actividad de la enzima PAL. Este aumento resulta en una menor susceptibilidad a Botrytis cinerea.

Research

Adolescentes artificiales

La reacción inversa catalizada por PAL se ha explorado para convertir el ácido trans-cinámico en L-fenilalanina, precursor del edulcorante aspartamo. Este proceso fue desarrollado por Genex Corporation, pero nunca se comercializó.

Síntesis de aminoácidos no naturales

De forma similar a cómo se sintetiza el aspartamo, la PAL también se utiliza para sintetizar aminoácidos artificiales a partir de diversos ácidos cinámicos sustituidos con fines de investigación. Sin embargo, el impedimento estérico derivado de la sustitución de arenos limita la utilidad de la PAL para este propósito. Por ejemplo, cuando se utilizó Rhodotorula glutinis para esta biotransformación, se descubrió que la enzima era intolerante a todos los sustituyentes para excepto al flúor, presumiblemente debido al pequeño radio atómico del elemento. Se descubrió que las posiciones meta y orto eran más tolerantes, pero aún limitadas por sustituyentes más grandes. Por ejemplo, el sitio activo de la enzima permitía la sustitución orto de metoxi, pero prohibía la meta de etoxi. Otros organismos con diferentes versiones de la enzima podrían estar menos limitados de esta manera.

Estudios estructurales

A finales de 2007, se habían resuelto cinco estructuras para esta clase de enzimas, con los códigos de acceso PDB 1T6J, 1T6P, 1W27, 1Y2M y 2NYF.

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Más lectura

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