Fase S

fase S (fase de síntesis) es la fase del ciclo celular en la que se replica el ADN, ocurriendo entre la fase G1 y la fase G2. Dado que la duplicación precisa del genoma es fundamental para una división celular exitosa, los procesos que ocurren durante la fase S están estrechamente regulados y ampliamente conservados.

Reglamento

La entrada en fase S está controlada por el punto de restricción G1 (R), que compromete células al resto del ciclo celular si hay nutrientes adecuados y señalización de crecimiento. Esta transición es esencialmente irreversible; después de pasar el punto de restricción, la célula progresará a través de la fase S incluso si las condiciones ambientales se vuelven desfavorables.

En consecuencia, la entrada a la fase S está controlada por vías moleculares que facilitan un cambio rápido y unidireccional en el estado celular. En la levadura, por ejemplo, el crecimiento celular induce la acumulación de ciclina Cln3, que forma complejos con la quinasa CDK2 dependiente de ciclina. El complejo Cln3-CDK2 promueve la transcripción de genes de fase S al inactivar el represor transcripcional Whi5. Dado que la regulación positiva de los genes de la fase S impulsa una mayor supresión de Whi5, esta vía crea un circuito de retroalimentación positiva que compromete completamente a las células a la expresión del gen de la fase S.

Existe un esquema regulatorio notablemente similar en las células de mamíferos. Las señales mitogénicas recibidas a lo largo de la fase G1 provocan una acumulación gradual de ciclina D, que forma complejos con CDK4/6. El complejo activo de ciclina D-CDK4/6 induce la liberación del factor de transcripción E2F, que a su vez inicia la expresión de genes de fase S. Varios genes diana de E2F promueven una mayor liberación de E2F, creando un circuito de retroalimentación positiva similar al que se encuentra en la levadura.

Replicación del ADN

A lo largo de la fase M y la fase G1, las células ensamblan complejos de pre-replicación inactivos (pre-RC) en orígenes de replicación distribuidos por todo el genoma. Durante la fase S, la célula convierte los pre-RC en horquillas de replicación activas para iniciar la replicación del ADN. Este proceso depende de la actividad quinasa de Cdc7 y de varias CDK en fase S, las cuales están reguladas positivamente tras la entrada en fase S.

La activación del pre-RC es un proceso estrechamente regulado y altamente secuencial. Después de que las CDK de fase S y Cdc7 fosforilan sus respectivos sustratos, un segundo conjunto de factores replicativos se asocia con el pre-RC. La asociación estable estimula a la helicasa MCM a desenrollar un pequeño tramo de ADN parental en dos hebras de ADNss, que a su vez recluta la proteína A de replicación (RPA), una proteína de unión a ADNss. El reclutamiento de RPA prepara la horquilla de replicación para la carga de ADN polimerasas replicativas y abrazaderas deslizantes de PCNA. La carga de estos factores completa la bifurcación de replicación activa e inicia la síntesis de ADN nuevo.

El ensamblaje completo de la bifurcación de replicación y la activación solo ocurren en un pequeño subconjunto de orígenes de replicación. Todos los eucariotas poseen muchos más orígenes de replicación de los estrictamente necesarios durante un ciclo de replicación del ADN. Los orígenes redundantes pueden aumentar la flexibilidad de la replicación del ADN, permitiendo a las células controlar la tasa de síntesis del ADN y responder al estrés de la replicación.

Síntesis de histonas

Dado que el ADN nuevo debe empaquetarse en nucleosomas para funcionar correctamente, la síntesis de proteínas histonas canónicas (no variantes) se produce junto con la replicación del ADN. Durante la fase S temprana, el complejo ciclina E-Cdk2 fosforila NPAT, un coactivador nuclear de la transcripción de histonas. NPAT se activa por fosforilación y recluta el complejo remodelador de cromatina Tip60 en los promotores de genes de histonas. La actividad de Tip60 elimina las estructuras inhibidoras de la cromatina e impulsa un aumento de tres a diez veces en la tasa de transcripción.

Además de aumentar la transcripción de genes de histonas, la entrada en fase S también regula la producción de histonas a nivel de ARN. En lugar de colas poliadeniladas, las transcripciones de histonas canónicas poseen un motivo de bucle de tallo 3' conservado que se une selectivamente a la proteína de unión a bucle de tallo (SLBP). La unión de SLBP es necesaria para el procesamiento, la exportación y la traducción eficientes de los ARNm de histonas, lo que le permite funcionar como un "interruptor" bioquímico altamente sensible. Durante la fase S, la acumulación de SLBP actúa junto con NPAT para aumentar drásticamente la eficiencia de la producción de histonas. Sin embargo, una vez que finaliza la fase S, tanto la SLBP como el ARN unido se degradan rápidamente. Esto detiene inmediatamente la producción de histonas y previene una acumulación tóxica de histonas libres.

Replicación en núcleo

Las histonas libres producidas por la célula durante la fase S se incorporan rápidamente en nuevos núcleos. Este proceso está estrechamente ligado al tenedor de replicación, que ocurre inmediatamente en “front” y “detrás” del complejo de replicación. La translocación de la helicasa MCM a lo largo de la hebra principal interrumpe los octameros del núcleo paterno, lo que da lugar a la liberación de subunidades H3-H4 y H2A-H2B. El reajuste de los nucleosomas detrás de la horquilla de replicación está mediado por factores de ensamblaje de cromatina (CAFs) que están asociados flojamente con proteínas de replicación. Aunque no se entiende completamente, la reasignación no parece utilizar el esquema semiconservador visto en la replicación del ADN. Los experimentos de etiquetado indican que la duplicación del núcleo es predominantemente conservadora. El núcleo paterno H3-H4 se mantiene completamente segregado de H3-H4 recientemente sintetizado, lo que resulta en la formación de los núcleos que contienen exclusivamente H3-H4 antiguo o exclusivamente nuevo H3-H4. Las histonas “antiguas” y “nuevas” se asignan a cada hilera semi-aleatoriamente, dando como resultado una división igual de modificaciones regulatorias.

Reestablecimiento de dominios de cromatina

Inmediatamente después de la división, cada cromátida hija solo posee la mitad de las modificaciones epigenéticas presentes en la cromátida paterna. La célula debe utilizar este conjunto parcial de instrucciones para restablecer los dominios de cromatina funcionales antes de entrar en la mitosis.

Para regiones genómicas grandes, la herencia de nucleosomas H3-H4 antiguos es suficiente para un restablecimiento preciso de los dominios de cromatina. El Complejo Represivo 2 de Polycomb (PRC2) y varios otros complejos modificadores de histonas pueden "copiar" las sustancias. modificaciones presentes en histonas antiguas sobre histonas nuevas. Este proceso amplifica las marcas epigenéticas y contrarresta el efecto dilutivo de la duplicación de nucleosomas.

Sin embargo, para dominios pequeños que se aproximan al tamaño de genes individuales, los nucleosomas antiguos están demasiado diseminados para una propagación precisa de las modificaciones de las histonas. En estas regiones, la estructura de la cromatina probablemente esté controlada por la incorporación de variantes de histonas durante el reensamblaje del nucleosoma. La estrecha correlación observada entre H3.3/H2A.Z y las regiones transcripcionalmente activas respalda este mecanismo propuesto. Desafortunadamente, aún no se ha demostrado una relación causal.

Puntos de control de daños en el ADN

Durante la fase S, la célula examina continuamente su genoma en busca de anomalías. La detección de daños en el ADN induce la activación de tres "vías de puntos de control" de fase S canónicas. que retrasan o detienen una mayor progresión del ciclo celular:

1. El Punto de comprobación de replicación detecta tintas de replicación estancadas integrando señales de RPA, ATR Interacting Protein (ATRIP) y RAD17. Tras la activación, el puesto de control de replicación regula la biosíntesis de nucleótido y bloquea la iniciación de la replicación de orígenes no encendidos. Ambos procesos contribuyen al rescate de horquillas estancadas aumentando la disponibilidad de dNTPs.
2. El S-M Checkpoint bloquea la mitosis hasta que todo el genoma se haya duplicado con éxito. Esta vía induce el arresto inhibiendo el complejo Cyclin-B-CDK1, que se acumula gradualmente a lo largo del ciclo celular para promover la entrada mitótica.
3. El Punto de control de fase intra-S detecta dobles rupturas de tiradas (DSBs) mediante la activación de cinasas ATR y ATM. Además de facilitar la reparación del ADN, ATR y ATM activan la progresión del ciclo celular promoviendo la degradación del CDC25A, una fosfatasa que elimina los residuos de fosfato inhibitorio de los CDK. La recombinación homologosa, un proceso preciso para reparar las roturas de doble tirada de ADN, es más activa en la fase S, disminuye en G2/M y está casi ausente en la fase G1.

Además de estos puntos de control canónicos, la evidencia reciente sugiere que las anomalías en el suministro de histonas y el ensamblaje de nucleosomas también pueden alterar la progresión de la fase S. El agotamiento de las histonas libres en las células de Drosophila prolonga drásticamente la fase S y provoca una detención permanente en la fase G2. Este fenotipo de detención único no está asociado con la activación de vías canónicas de daño al ADN, lo que indica que el ensamblaje de nucleosomas y el suministro de histonas pueden ser examinados mediante un nuevo punto de control de fase S.