Experimento de Nirenberg y Matthaei

El experimento de Nirenberg y Matthaei fue un experimento científico realizado en mayo de 1961 por Marshall W. Nirenberg y su becario postdoctoral, J. Heinrich Matthaei, en los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El experimento descifró el primero de los 64 codones tripletes del código genético mediante el uso de homopolímeros de ácidos nucleicos para traducir aminoácidos específicos.

En el experimento, se preparó un extracto a partir de células bacterianas que podían producir proteínas sin la presencia de células vivas intactas. Se añadió al extracto una forma artificial de ARN compuesta enteramente de nucleótidos que contienen uracilo (ácido poliuridílico o poli-U), lo que provocó que se formara una proteína compuesta enteramente del aminoácido fenilalanina. Este experimento descifró el primer codón del código genético y demostró que el ARN controlaba la producción de tipos específicos de proteínas.

Fondo

Los descubrimientos de Frederick Griffith y mejorados por Oswald Avery descubrieron que la sustancia responsable de producir cambios heredables en las bacterias que causan enfermedades (Streptococcus pneumoniae) no era ni una proteína ni un lípido, sino ácido desoxirribonucleico. (ADN). En 1944, él y sus colegas Colin MacLeod y Maclyn McCarty sugirieron que el ADN era responsable de la transferencia de información genética. Posteriormente, Erwin Chargaff (1950) descubrió que la composición del ADN difiere de una especie a otra. Estos experimentos ayudaron a allanar el camino para el descubrimiento de la estructura del ADN. En 1953, con la ayuda de la cristalografía de rayos X de Maurice Wilkins y Rosalind Franklin, James Watson y Francis Crick propusieron que el ADN está estructurado como una doble hélice.

En la década de 1960, uno de los principales misterios del ADN que los científicos necesitaban descubrir era el número de bases encontradas en cada palabra clave, o codón, durante la transcripción. Los científicos sabían que había un total de cuatro bases (guanina, citosina, adenina y timina). También sabían que había 20 aminoácidos conocidos. George Gamow sugirió que el código genético estaba formado por tres nucleótidos por aminoácido. Razonó que debido a que hay 20 aminoácidos y sólo cuatro bases, las unidades codificantes no podían ser simples (4 combinaciones) o pares (sólo 16 combinaciones). Más bien, pensaba que los trillizos (64 combinaciones posibles) eran la unidad codificadora del código genético. Sin embargo, propuso que los trillizos se superpusieran y no fueran degenerados (más tarde explicado por Crick en su concepto Wobble).

A finales de la década de 1950, Seymour Benzer había desarrollado un ensayo utilizando mutaciones de fagos que proporcionó el primer mapa detallado estructurado linealmente de una región genética. Crick sintió que podía utilizar la mutagénesis y la recombinación genética de fagos para delinear mejor la naturaleza del código genético. En Crick, Brenner et al. experimento, utilizando estos fagos, se confirmó la naturaleza triple del código genético. Utilizaron mutaciones de cambio de marco y un proceso llamado reversiones para agregar y eliminar varios números de nucleótidos. Cuando se añadió o eliminó un triplete de nucleótidos a la secuencia de ADN, la proteína codificada se vio mínimamente afectada. Así, concluyeron que el código genético es un código triplete porque no provoca un desplazamiento del marco de lectura. Concluyeron correctamente que el código es degenerado (múltiples tripletes pueden corresponder a un solo aminoácido) y que cada secuencia de nucleótidos se lee desde un punto de partida específico.

Trabajo experimental

Para descifrar este misterio biológico, Nirenberg y Matthaei necesitaban un sistema libre de células que pudiera convertir los aminoácidos en proteínas. Siguiendo el trabajo de Alfred Tissieres y después de algunos intentos fallidos, crearon un sistema estable rompiendo E. coli células de la bacteria y liberando el contenido del citoplasma. Esto les permitió sintetizar proteínas, pero sólo cuando se añadió el tipo correcto de ARN, lo que permitió a Nirenberg y Matthaei controlar el experimento. Crearon moléculas de ARN sintético fuera de la bacteria e introdujeron este ARN en la E. coli sistema. Los experimentos utilizaron mezclas con los 20 aminoácidos. Para cada experimento individual, 19 aminoácidos fueron sometidos a tratamiento "frío" (no radiactivo), y uno estaba "caliente" (etiquetado radiactivamente con ¹⁴C para poder detectar el aminoácido marcado más tarde). Variaron el menú "caliente" aminoácido en cada ronda del experimento, buscando determinar qué aminoácidos se incorporarían a una proteína luego de la adición de un tipo particular de ARN sintético.

Los primeros experimentos clave se realizaron con poli-U (ARN sintético compuesto únicamente de bases de uridina, proporcionado por Leon Heppel y Maxine Singer). A las 3 de la madrugada del 27 de mayo de 1961, Matthaei utilizó fenilalanina como medicamento "caliente". aminoácidos. Después de una hora, el tubo de control (sin poli-U) mostró un nivel de fondo de 70 cuentas, mientras que el tubo con poli-U añadido mostró 38.000 cuentas por miligramo de proteína. Experimentos posteriores demostraron que los 19 "fríos" Los aminoácidos no eran necesarios y que el producto proteico tenía las características bioquímicas de la polifenilalanina, lo que demuestra que una cadena de bases de uracilo repetidas producía una cadena proteica compuesta únicamente del aminoácido repetido fenilalanina. Si bien el experimento no determinó el número de bases por codón, fue consistente con el codón triplete UUU que codifica la fenilalanina.

En experimentos análogos con otros ARN sintéticos, descubrieron que el poli-C dirigía la síntesis de poliprolina. Nirenberg relata que los laboratorios de Severo Ochoa y James Watson habían realizado anteriormente experimentos similares con poli-A, pero no lograron detectar la síntesis de proteínas porque la polilisina (a diferencia de la mayoría de las proteínas) es soluble en ácido tricloroacético. Además, utilizando ARN sintéticos que incorporaban aleatoriamente dos bases en diferentes proporciones, produjeron proteínas que contenían más de un tipo de aminoácido, a partir de las cuales podían deducir la naturaleza triplete del código genético y reducir las posibilidades de codones para otros aminoácidos. El grupo de Nirenberg finalmente decodificó todos los codones de aminoácidos en 1966, sin embargo, esto requirió métodos experimentales ingeniosos adicionales (ver experimento de Nirenberg y Leder).

Recepción y legado

En agosto de 1961, en el Congreso Internacional de Bioquímica celebrado en Moscú, Nirenberg presentó los experimentos poli-U, primero a un grupo pequeño, pero luego, a instancias de Francis Crick, nuevamente ante unos mil asistentes. La obra fue recibida con mucho entusiasmo y Nirenberg se hizo famoso de la noche a la mañana. El artículo que describe el trabajo se publicó el mismo mes.

El experimento marcó el comienzo de una carrera furiosa para descifrar completamente el código genético. El principal competidor de Nirenberg era el estimado bioquímico Severo Ochoa. El Dr. Ochoa y el Dr. Arthur Kornberg compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1959 por su "descubrimiento previo de los mecanismos de la síntesis biológica del ácido ribonucleico y del ácido desoxirribonucleico". Sin embargo, muchos colegas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) apoyaron a Nirenberg, conscientes de que podría conducir al primer premio Nobel para un científico interno de los NIH. DeWitt Stetten Jr., el director de los NIH que contrató por primera vez a Nirenberg, calificó este período de colaboración como "el mejor momento de los NIH".

De hecho, "por su interpretación del código genético y su función en la síntesis de proteínas," Marshall W. Nirenberg, Robert W. Holley y Har Gobind Khorana recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1968. Trabajando de forma independiente, el Dr. Holley (Universidad de Cornell) había descubierto la estructura química exacta del ARN de transferencia, y el Dr. Khorana (Universidad de Wisconsin en Madison) había dominado la síntesis de ácidos nucleicos. El Dr. Nirenberg demostró, excluyendo los codones sin sentido, que cada combinación de un triplete (es decir, un codón) compuesto de cuatro bases diferentes que contienen nitrógeno que se encuentran en el ADN y el ARN produce un aminoácido específico.

The New York Times dijo sobre el descubrimiento de Nirenberg que "la ciencia de la biología ha alcanzado una nueva frontera", dijo. conduciendo a "una revolución mucho mayor en su significado potencial que la bomba atómica o de hidrógeno". La mayor parte de la comunidad científica consideró estos experimentos muy importantes y beneficiosos. Sin embargo, hubo algunos que estaban preocupados por la nueva área de la genética molecular. Por ejemplo, Arne Tiselius, premio Nobel de Química en 1948, afirmó que el conocimiento del código genético podría "conducir a métodos para alterar la vida, crear nuevas enfermedades, controlar mentes, influir en la herencia, incluso tal vez en ciertos casos". direcciones deseadas."

Además del Premio Nobel, el Dr. Nirenberg ha recibido el Premio de Biología Molecular de la Academia Nacional de Ciencias y el Premio de Ciencias Biológicas de la Academia de Ciencias de Washington (1962), el Premio Paul Lewis de la Sociedad Química Americana (1963), la Medalla del Departamento de Salud, Educación y Bienestar, junto con el Premio Harrison Howe de la Sociedad Química Americana de EE.UU., en América (1864).