Espectroscopia de coherencia cuántica única heteronuclear
El experimento de coherencia cuántica única heteronuclear o correlación cuántica única heteronuclear, normalmente abreviado como HSQC, se utiliza frecuentemente en espectroscopia de RMN de moléculas orgánicas. y es de particular importancia en el campo de la RMN de proteínas. El experimento fue descrito por primera vez por Geoffrey Bodenhausen y D. J. Ruben en 1980. El espectro resultante es bidimensional (2D) con un eje para el protón (1H) y el otro para un heteronúcleo (un núcleo atómico distinto de un protón), que suele ser 13C o 15N. El espectro contiene un pico para cada protón único unido al heteronúcleo que se está considerando. El HSQC 2D también se puede combinar con otros experimentos de RMN de dimensiones superiores, como NOESY-HSQC o TOCSY-HSQC.
Esquema general
El experimento HSQC es un experimento de RMN 2D altamente sensible y se describió por primera vez en un sistema 1H—15N, pero también es aplicable a otros núcleos como 1H—13C y 1H—31P. El esquema básico de este experimento implica la transferencia de magnetización del protón al segundo núcleo, que puede ser 15N, 13C o 31 P, a través de un paso INEPT (núcleos insensibles mejorados por transferencia de polarización). Después de un retraso de tiempo (t1), la magnetización se transfiere de nuevo al protón mediante un paso retro-INEPT y luego se registra la señal. En HSQC, se registra una serie de experimentos en los que se incrementa el retardo de tiempo t1. La señal 1H se detecta en la dimensión medida directamente en cada experimento, mientras que el cambio químico de 15N o 13C se registra en la Dimensión indirecta que se forma a partir de la serie de experimentos.
HSQC en RMN de proteínas
1H—15N HSQC
El experimento 15N HSQC es uno de los experimentos registrados con más frecuencia en RMN de proteínas. El experimento HSQC se puede realizar utilizando la abundancia natural del isótopo 15N, pero normalmente para la RMN de proteínas se utilizan proteínas marcadas isotópicamente. Estas proteínas marcadas generalmente se producen expresando la proteína en células cultivadas en medios marcados con 15N.
Cada residuo de la proteína, con excepción de la prolina, tiene un protón amida unido a un nitrógeno en el enlace peptídico. El HSQC proporciona la correlación entre el protón de nitrógeno y amida, y cada amida produce un pico en los espectros de HSQC. Por lo tanto, cada residuo (excepto la prolina) puede producir un pico observable en los espectros, aunque en la práctica no siempre se ven todos los picos debido a una serie de factores. Normalmente, el residuo N-terminal (que tiene un grupo NH3+ unido) no es fácilmente observable debido al intercambio con el disolvente. Además de las resonancias de amida de la columna vertebral, las cadenas laterales con protones unidos a nitrógeno también producirán picos.
En un espectro HSQC típico, los picos de NH2 de las cadenas laterales de asparagina y glutamina aparecen como dobletes en la esquina superior derecha, y puede aparecer un pico más pequeño encima de cada pico debido al deuterio. intercambio del D2O que normalmente se agrega a una muestra de RMN, lo que le da a estos picos de cadena lateral una apariencia distintiva. Los picos de amina de cadena lateral del triptófano generalmente se desplazan hacia abajo y aparecen cerca de la esquina inferior izquierda. Los picos de amida principal de la glicina normalmente aparecen cerca de la parte superior del espectro.
El HSQC 15N es normalmente el primer espectro heteronuclear adquirido para la asignación de resonancias donde cada pico de amida se asigna a un residuo particular en la proteína. Si la proteína está plegada, los picos suelen estar bien dispersos y se pueden distinguir la mayoría de los picos individuales. Si hay un gran grupo de picos muy superpuestos alrededor de la mitad del espectro, eso indicaría la presencia de elementos no estructurados significativos en la proteína. En los casos en los que existe una superposición importante de resonancias, la asignación de resonancias en los espectros puede resultar difícil. La asignación del espectro HSQC requiere otros experimentos, idealmente usando experimentos de triple resonancia con proteínas marcadas con 15N y 13C, que proporcionen conectividades secuenciales entre residuos para que las resonancias puedan estar vinculados a residuos particulares y asignados secuencialmente. La asignación del espectro es esencial para una interpretación significativa de experimentos de RMN más avanzados, como la determinación de estructuras y el análisis de relajación.
Las sustancias químicas marcadas con el isótopo 15N son relativamente económicas, y el 15N HSQC es un experimento sensible mediante el cual se puede adquirir un espectro en un tiempo relativamente corto, el < Por lo tanto, el HSQC 15 N se utiliza a menudo para seleccionar candidatos en cuanto a su idoneidad para la determinación de la estructura mediante RMN, así como para la optimización de las condiciones de la muestra. El proceso de determinación de la estructura, que requiere mucho tiempo, generalmente no se lleva a cabo hasta que se pueda obtener un buen espectro HSQC. El experimento HSQC también es útil para detectar la interfaz de unión en la interacción proteína-proteína, así como las interacciones con ligandos como los fármacos. Al comparar el HSQC de la proteína libre con la unida al ligando, se pueden observar cambios en los cambios químicos de algunos picos, y es probable que estos picos se encuentren en la superficie de unión donde la unión perturbó sus cambios químicos. El 15N HSQC también se puede utilizar en análisis de relajación en los estudios de dinámica molecular de proteínas, la determinación de la constante de ionización y otros estudios.
1H—13C HSQC
Este experimento proporciona correlaciones entre un carbono y sus protones unidos. La versión de tiempo constante (CT) de 1H—13C HSQC se utiliza normalmente ya que evita el problema de la división de la señal debido al 13C—13C J acoplamientos que reducen la resolución espectral. El "tiempo constante" se refiere a todo el período de evolución entre los dos pasos de INEPT que se mantiene constante en este experimento. Si este período de evolución se establece como el inverso de la constante de acoplamiento J, entonces el signo de la magnetización de aquellos carbonos con un número impar de carbonos alifáticos unidos será opuesto al de aquellos con un número par. Por ejemplo, si el Cβ de la leucina aparece como un pico positivo (2 carbonos alifáticos unidos), entonces el Cγ (3 carbonos alifáticos unidos) y el Cα (1 carbono alifático) carbonos unidos) parecería negativo.
HSQC en RMN de lípidos
1H—31P HSQC
El uso de 1H—31P HSQC es relativamente poco común en lipidómica; sin embargo, el uso de 31P en lipidómica se remonta a la Década de 1990. El uso de esta técnica es limitado con respecto a la espectrometría de masas debido a que requiere un tamaño de muestra mucho mayor; sin embargo, la combinación de 1H—31P HSQC con espectrometría de masas es considerado como un enfoque exhaustivo de la lipidómica y las técnicas de 'espectroscopia dual' están cada vez más disponibles.