Espectrometría de masas de proteínas

La espectrometría de masas de proteínas se refiere a la aplicación de la espectrometría de masas al estudio de las proteínas. La espectrometría de masas es un método importante para la determinación precisa de la masa y la caracterización de las proteínas, y se han desarrollado diversos métodos e instrumentos para sus múltiples usos. Sus aplicaciones incluyen la identificación de proteínas y sus modificaciones postraduccionales, la elucidación de complejos proteicos, sus subunidades e interacciones funcionales, así como la medición global de proteínas en proteómica. También puede utilizarse para localizar proteínas en los diversos orgánulos y determinar las interacciones entre diferentes proteínas, así como con los lípidos de la membrana.

Los dos métodos principales utilizados para la ionización de proteínas en espectrometría de masas son la ionización por electrospray (ESI) y la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI). Estas técnicas de ionización se utilizan junto con analizadores de masas como la espectrometría de masas en tándem. En general, las proteínas se analizan mediante un enfoque "de arriba a abajo", en el que se analizan intactas, o mediante un enfoque "de abajo a arriba", en el que primero se digieren en fragmentos. En ocasiones, también se puede utilizar un enfoque intermedio, "de medio a abajo", en el que se analizan fragmentos peptídicos más grandes.La aplicación de la espectrometría de masas al estudio de proteínas se popularizó en la década de 1980 tras el desarrollo de MALDI y ESI. Estas técnicas de ionización han desempeñado un papel fundamental en la caracterización de proteínas. El término MALDI (ionización por desorción láser asistida por matriz) fue acuñado a finales de la década de 1980 por Franz Hillenkamp y Michael Karas. Hillenkamp, Karas y sus colegas investigadores lograron ionizar el aminoácido alanina mezclándolo con el aminoácido triptófano e irradiándolo con un láser pulsado de 266 nm. Si bien fue importante, el avance no se produjo hasta 1987. En ese mismo año, Koichi Tanaka utilizó el «método de metal ultrafino más matriz líquida» e ionizó biomoléculas del tamaño de 34 472 Da de la proteína carboxipeptidasa-A.En 1968, Malcolm Dole reportó el primer uso de la ionización por electrospray con espectrometría de masas. Casi al mismo tiempo que se popularizó MALDI, John Bennett Fenn fue citado por el desarrollo de la ionización por electrospray. Koichi Tanaka recibió el Premio Nobel de Química en 2002 junto con John Fenn y Kurt Wüthrich "por el desarrollo de métodos para la identificación y el análisis estructural de macromoléculas biológicas". Estos métodos de ionización han facilitado enormemente el estudio de las proteínas mediante espectrometría de masas. En consecuencia, la espectrometría de masas de proteínas ahora desempeña un papel fundamental en la caracterización de proteínas.La espectrometría de masas de proteínas requiere que las proteínas en solución o estado sólido se ionicen en fase gaseosa antes de inyectarlas y acelerarlas en un campo eléctrico o magnético para su análisis. Los dos métodos principales para la ionización de proteínas son la ionización por electrospray (ESI) y la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI). En la electrospray, los iones se crean a partir de proteínas en solución, lo que permite ionizar intactas moléculas frágiles, preservando en ocasiones las interacciones no covalentes. En la MALDI, las proteínas se incrustan en una matriz, normalmente en forma sólida, y los iones se crean mediante pulsos de luz láser. La electrospray produce más iones con carga múltiple que la MALDI, lo que permite la medición de proteínas de alta masa y una mejor fragmentación para su identificación, mientras que la MALDI es rápida y menos propensa a verse afectada por contaminantes, soluciones tampón y aditivos.El análisis de la masa de la proteína completa se realiza principalmente mediante espectrometría de masas (EM) de tiempo de vuelo (TOF) o resonancia ciclotrónica iónica por transformada de Fourier (FT-ICR). Estos dos tipos de instrumentos son preferibles en este caso debido a su amplio rango de masas y, en el caso de la FT-ICR, a su alta precisión de masa. La ionización por electrospray de una proteína suele generar múltiples especies cargadas de 800 < m/z < 2000, y el espectro resultante puede deconvolucionarse para determinar la masa promedio de la proteína con una precisión de 50 ppm o inferior mediante instrumentos TOF o de trampa de iones.El análisis de masas de péptidos proteolíticos es un método popular para la caracterización de proteínas, ya que se pueden utilizar instrumentos de diseño más económico. Además, la preparación de las muestras es más sencilla una vez que las proteínas completas se han digerido en fragmentos peptídicos más pequeños. Los instrumentos más utilizados para el análisis de masas de péptidos son los MALDI-TOF, ya que permiten la adquisición de huellas de masas de péptidos (PMF) a alta velocidad (1 PMF se puede analizar en aproximadamente 10 segundos). El tiempo de vuelo cuadrupolo de múltiples etapas y la trampa de iones cuadrupolo también se utilizan en esta aplicación.

La espectrometría de masas en tándem (MS/MS) se utiliza para medir espectros de fragmentación e identificar proteínas con alta velocidad y precisión. La disociación inducida por colisión se utiliza en aplicaciones convencionales para generar un conjunto de fragmentos a partir de un ion peptídico específico. El proceso de fragmentación genera principalmente productos de escisión que se rompen a lo largo de los enlaces peptídicos. Debido a esta simplicidad en la fragmentación, es posible utilizar las masas de los fragmentos observados para compararlas con una base de datos de masas predichas para una de las muchas secuencias peptídicas dadas. La espectrometría de masas en tándem de iones proteicos completos se ha investigado recientemente mediante disociación por captura de electrones y ha demostrado, en teoría, una amplia información de la secuencia, pero no es una práctica común.De acuerdo con el rendimiento y el rango de masas de los espectrómetros de masas disponibles, se utilizan dos enfoques para caracterizar las proteínas. En el primero, las proteínas intactas se ionizan mediante una de las dos técnicas descritas anteriormente y luego se introducen en un analizador de masas. Este enfoque se conoce como estrategia de análisis de proteínas "de arriba a abajo", ya que implica comenzar con la masa total y luego separarla. Sin embargo, este enfoque se limita principalmente a estudios de proteínas individuales de bajo rendimiento debido a los problemas que implica el manejo de proteínas completas, su heterogeneidad y la complejidad de sus análisis.En el segundo enfoque, conocido como espectrometría de masas "ascendente", las proteínas se digieren enzimáticamente en péptidos más pequeños mediante una proteasa como la tripsina. Posteriormente, estos péptidos se introducen en el espectrómetro de masas y se identifican mediante huella de masas peptídica o espectrometría de masas en tándem. Por lo tanto, este enfoque utiliza la identificación a nivel de péptidos para inferir la existencia de proteínas recompuestas mediante la detección de repeticiones de novo. Los fragmentos más pequeños y uniformes son más fáciles de analizar que las proteínas intactas y, además, pueden determinarse con alta precisión. Por lo tanto, este enfoque "ascendente" es el método preferido de estudio en proteómica. Otro enfoque que está comenzando a ser útil es el enfoque intermedio "medio-abajo", en el que se analizan péptidos proteolíticos más grandes que los péptidos trípticos típicos.

Las proteínas de interés suelen formar parte de una mezcla compleja de múltiples proteínas y moléculas que coexisten en el medio biológico. Esto presenta dos problemas importantes. En primer lugar, las dos técnicas de ionización utilizadas para moléculas grandes solo funcionan bien cuando la mezcla contiene cantidades aproximadamente iguales de material, mientras que en las muestras biológicas, las diferentes proteínas tienden a estar presentes en cantidades muy dispares. Si dicha mezcla se ioniza mediante electrospray o MALDI, las especies más abundantes tienden a "ahogar" o suprimir las señales de las menos abundantes. En segundo lugar, el espectro de masas de una mezcla compleja es muy difícil de interpretar debido a la gran cantidad de componentes de la mezcla. Esto se ve agravado por el hecho de que la digestión enzimática de una proteína da lugar a una gran cantidad de productos peptídicos.Ante estos problemas, los métodos de electroforesis en gel unidimensional y bidimensional, y la cromatografía líquida de alta resolución se utilizan ampliamente para la separación de proteínas. El primer método fracciona las proteínas completas mediante electroforesis en gel bidimensional. La primera dimensión del gel 2D es el isoelectroenfoque (IEF). En esta dimensión, la proteína se separa por su punto isoeléctrico (pI), y la segunda dimensión es la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). Esta dimensión separa la proteína según su peso molecular. Una vez completado este paso, se produce la digestión en gel. En algunas situaciones, puede ser necesario combinar ambas técnicas. Las manchas de gel identificadas en un gel 2D suelen atribuirse a una proteína. Si se desea identificar la proteína, se suele aplicar el método de digestión en gel, donde se extirpa la mancha de proteína de interés y se digiere proteolíticamente. Las masas peptídicas resultantes de la digestión pueden determinarse mediante espectrometría de masas mediante la identificación de masas peptídicas. Si esta información no permite la identificación inequívoca de la proteína, sus péptidos pueden someterse a espectrometría de masas en tándem para la secuenciación de novo. Con 2D-PAGE, se pueden detectar pequeños cambios de masa y carga. Las desventajas de esta técnica son su pequeño rango dinámico en comparación con otros métodos; algunas proteínas siguen siendo difíciles de separar debido a su acidez, basicidad, hidrofobicidad y tamaño (demasiado grande o demasiado pequeño).El segundo método, la cromatografía líquida de alta resolución, se utiliza para fraccionar péptidos tras la digestión enzimática. La caracterización de mezclas de proteínas mediante HPLC/MS también se denomina proteómica shotgun y MuDPIT (Tecnología de Identificación Multidimensional de Proteínas). Una mezcla de péptidos resultante de la digestión de una mezcla de proteínas se fracciona mediante uno o dos pasos de cromatografía líquida. El eluyente de la etapa de cromatografía puede introducirse directamente en el espectrómetro de masas mediante ionización por electrospray o depositarse en una serie de pequeñas manchas para su posterior análisis de masas mediante MALDI.Existen dos métodos principales para identificar proteínas mediante espectrometría de masas (MS). La huella de masa de péptidos utiliza las masas de los péptidos proteolíticos como entrada para una búsqueda en una base de datos de masas predichas que surgirían de la digestión de una lista de proteínas conocidas. Si una secuencia de proteína en la lista de referencia da lugar a un número significativo de masas predichas que coinciden con los valores experimentales, existe evidencia de que esta proteína estaba presente en la muestra original. Por lo tanto, los pasos de purificación limitan el rendimiento del método de huella de masa de péptidos. Como alternativa, los péptidos pueden fragmentarse mediante MS/MS para una identificación más definitiva.La EM también es el método preferido para la identificación de modificaciones postraduccionales en proteínas, frente a otros enfoques, como los basados en anticuerpos.La secuenciación de péptidos de novo para espectrometría de masas se realiza generalmente sin conocimiento previo de la secuencia de aminoácidos. Consiste en el proceso de asignar aminoácidos a partir de las masas de fragmentos peptídicos de una proteína. La secuenciación de novo ha demostrado ser eficaz para confirmar y ampliar los resultados de las búsquedas en bases de datos.Dado que la secuenciación de novo se basa en la masa y algunos aminoácidos tienen masas idénticas (p. ej., leucina e isoleucina), la secuenciación manual precisa puede resultar difícil. Por lo tanto, puede ser necesario utilizar una aplicación de búsqueda de homología de secuencias que funcione en conjunto con la búsqueda en bases de datos y la secuenciación de novo para abordar esta limitación inherente.La búsqueda en bases de datos tiene la ventaja de identificar rápidamente secuencias, siempre que ya estén documentadas en una base de datos. Otras limitaciones inherentes a la búsqueda en bases de datos incluyen modificaciones/mutaciones de secuencias (algunas búsquedas no tienen en cuenta adecuadamente las alteraciones en la secuencia "documentada", por lo que pueden pasar por alto información valiosa), lo desconocido (si una secuencia no está documentada, no se encontrará), los falsos positivos y los datos incompletos y corruptos.Una biblioteca espectral de péptidos anotados también puede utilizarse como referencia para la identificación de proteínas/péptidos. Ofrece la ventaja única de un espacio de búsqueda reducido y una mayor especificidad. Las limitaciones incluyen que los espectros no incluidos en la biblioteca no se identificarán, que los espectros obtenidos con diferentes tipos de espectrómetros de masas pueden presentar características muy distintivas y que los espectros de referencia de la biblioteca pueden contener picos de ruido, lo que puede dar lugar a identificaciones de falsos positivos. Se han descrito diversos enfoques algorítmicos para identificar péptidos y proteínas mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS), secuenciación de novo de péptidos y búsqueda basada en etiquetas de secuencia.La presentación de antígenos es el primer paso para educar al sistema inmunitario a reconocer nuevos patógenos. Para ello, las células presentadoras de antígenos exponen fragmentos de proteínas a través de moléculas del CMH al sistema inmunitario. Sin embargo, no todos los fragmentos de proteínas se unen a las moléculas del CMH de un individuo en particular. Mediante espectrometría de masas, se puede determinar el verdadero espectro de moléculas presentadas al sistema inmunitario.

Existen múltiples métodos que permiten la cuantificación de proteínas mediante espectrometría de masas, y los avances recientes han permitido cuantificar miles de proteínas en células individuales. La cuantificación de proteínas mediante espectrometría de masas se beneficia de un muestreo (conteo) eficiente de muchos iones por proteína, en comparación con otros métodos. Las cuantificaciones pueden realizarse mediante métodos sin marcadores y mediante métodos multiplexados, que utilizan marcadores de masa isotópicos. Los métodos multiplexados pueden mejorar tanto la precisión cuantitativa como el rendimiento.Normalmente, los isótopos estables (p. ej., no radiactivos) más pesados de carbono (¹³C) o nitrógeno (¹⁵N) se incorporan a una muestra, mientras que la otra se marca con los isótopos ligeros correspondientes (p. ej., ¹²C y ¹⁴N). Las dos muestras se mezclan antes del análisis. Los péptidos derivados de las diferentes muestras se pueden distinguir debido a su diferencia de masa. La relación de sus intensidades máximas corresponde a la relación de abundancia relativa de los péptidos (y proteínas). La primera generación de métodos para el marcaje de isótopos incluyó SILAC (marcaje de isótopos estables por aminoácidos en cultivo celular), marcaje de ¹⁸O catalizado por tripsina, ICAT (marcaje de afinidad codificado por isótopos) e iTRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta). La generación más reciente de métodos de multiplexación incluye etiquetas de masa en tándem (TMT) para datos DDA y mTRAQ para DIA multiplexada (plexDIA).La espectrometría de masas semicuantitativa puede realizarse sin marcar las muestras. Normalmente, esto se realiza mediante análisis MALDI (en modo lineal). La intensidad o área de pico de las moléculas individuales (normalmente proteínas) se correlaciona con la cantidad de proteína en la muestra. Sin embargo, la señal individual depende de la estructura primaria de la proteína, de la complejidad de la muestra y de la configuración del instrumento. Otros tipos de espectrometría de masas cuantitativa sin marcaje utilizan los recuentos espectrales (o recuentos de péptidos) de las proteínas digeridas para determinar las cantidades relativas de proteína.Las características indicativas de la estructura tridimensional de las proteínas pueden investigarse mediante espectrometría de masas de diversas maneras. Comparar las distribuciones de estados de carga puede proporcionar información sobre la estructura de una proteína. Una amplia variedad de estados de carga altos indica desorden en la proteína, mientras que las proteínas más compactas y plegadas resultan en estados de carga más bajos. Mediante el uso de enlaces cruzados químicos para acoplar partes de la proteína cercanas en el espacio, pero muy separadas en la secuencia, se puede inferir información sobre la estructura general. Al seguir el intercambio de protones de amida con deuterio del disolvente, es posible investigar la accesibilidad al disolvente de varias partes de la proteína. La espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio se ha utilizado para estudiar proteínas y sus conformaciones durante más de 20 años. Este tipo de análisis estructural de proteínas puede ser adecuado para proteínas que presentan dificultades para otros métodos estructurales. Otra vía interesante en los estudios estructurales de proteínas es el marcaje covalente inducido por láser. En esta técnica, los sitios de la proteína expuestos al disolvente se modifican mediante radicales hidroxilo. Su combinación con la mezcla rápida se ha utilizado en estudios de plegamiento de proteínas.

En lo que ahora se conoce comúnmente como proteogenómica, los péptidos identificados mediante espectrometría de masas se utilizan para mejorar las anotaciones genéticas (por ejemplo, los sitios de inicio de genes) y las anotaciones de proteínas. El análisis paralelo del genoma y el proteoma facilita el descubrimiento de modificaciones postraduccionales y eventos proteolíticos, especialmente al comparar múltiples especies.