Esferoplasto

Un esferoplasto (o esferoplasto en el uso británico) es una célula microbiana cuya pared celular ha sido eliminada casi por completo, como por acción de la penicilina o la lisozima. Según algunas definiciones, el término se utiliza para describir las bacterias Gram negativas. Según otras definiciones, el término también abarca las levaduras. El nombre esferoplasto proviene del hecho de que después de que la pared celular del microbio se digiere, la tensión de la membrana hace que la célula adquiera una forma esférica característica. Los esferoplastos son osmóticamente frágiles y se lisarán si se transfieren a una solución hipotónica.

Cuando se utiliza para describir bacterias Gram negativas, el término esferoplasto se refiere a células de las que se ha eliminado el componente de peptidoglicano, pero no el componente de la membrana externa de la pared celular.

Formación de esferoplastos

Esferoplastos inducidos por antibióticos

Varios antibióticos convierten las bacterias gramnegativas en esferoplastos. Estos incluyen inhibidores de la síntesis de peptidoglicanos como fosfomicina, vancomicina, moenomicina, lactivicina y los antibióticos β-lactámicos. Los antibióticos que inhiben las vías bioquímicas directamente aguas arriba de la síntesis de peptidoglicanos también inducen esferoplastos (p. ej., fosmidomicina, fosfoenolpiruvato).

Además de los antibióticos anteriores, los inhibidores de la síntesis de proteínas (p. ej., cloranfenicol, oxitetraciclina, varios aminoglucósidos) y los inhibidores de la síntesis de ácido fólico (p. ej., trimetoprim, sulfametoxazol) también hacen que las bacterias gramnegativas formen esferoplastos.

Esferoplastos inducidos por enzimas

La enzima lisozima hace que las bacterias Gram negativas formen esferoplastos, pero solo si se utiliza un permeabilizador de membrana como lactoferrina o etilendiaminotetraacetato (EDTA) para facilitar el paso de la enzima a través de la membrana externa. El EDTA actúa como permeabilizador uniéndose a iones divalentes como Ca²⁺ y eliminándolos de la membrana externa.

La levadura Candida albicans se puede convertir en esferoplastos utilizando las enzimas liticasa, quitinasa y β-glucuronidasa.

Usos y aplicaciones

Descubrimiento de antibióticos

Desde la década de 1960 hasta la de 1990, Merck and Co. utilizó una pantalla de esferoplasto como método principal para descubrir antibióticos que inhiben la biosíntesis de la pared celular. En esta pantalla ideada por Eugene Dulaney, se expusieron bacterias en crecimiento a sustancias de prueba en condiciones hipertónicas. Los inhibidores de la síntesis de la pared celular hicieron que las bacterias en crecimiento formaran esferoplastos. Este cribado permitió descubrir fosfomicina, cefamicina C, tienamicina y varios carbapenémicos.

Sujeción del parche

Se pueden utilizar esferoplastos gigantes de bacterias Gram-negativas especialmente preparados para estudiar la función de los canales iónicos bacterianos mediante una técnica llamada patch clamp, que fue diseñada originalmente para caracterizar el comportamiento de las neuronas y otras células excitables. Para preparar esferoplastos gigantes, las bacterias se tratan con un inhibidor de la tabicación (por ejemplo, cefalexina). Esto hace que las bacterias formen filamentos, células alargadas que carecen de paredes transversales internas. Después de un período de tiempo, las paredes celulares de los filamentos se digieren y las bacterias colapsan en esferas muy grandes rodeadas solo por sus membranas citoplasmáticas y externas. Luego, las membranas se pueden analizar en un aparato de pinza de parche para determinar el fenotipo de los canales iónicos incrustados en ellas. También es común sobreexpresar un canal en particular para amplificar su efecto y hacerlo más fácil de caracterizar.

La técnica del parche de sujeción gigante E. coli se ha utilizado para estudiar los canales mecanosensibles nativos (MscL, MscS y MscM) de E. coli. Se ha ampliado para estudiar otros canales iónicos expresados de forma heteróloga y se ha demostrado que el gigante E. coli se puede utilizar como sistema de expresión de canales iónicos comparable al ovocito de Xenopus.

Lisis celular

Las células de levadura normalmente están protegidas por una pared celular gruesa que dificulta la extracción de proteínas celulares. La digestión enzimática de la pared celular con zimoliasa, que crea esferoplastos, hace que las células sean vulnerables a una fácil lisis con detergentes o cambios rápidos de presión osmolar.

Transfección

Los esferoplastos bacterianos, con ADN recombinante adecuado insertado en ellos, se pueden utilizar para transfectar células animales. Los esferoplastos con ADN recombinante se introducen en medios que contienen células animales y se fusionan con polietilenglicol (PEG). Con este método, casi el 100% de las células animales pueden absorber el ADN extraño. Al realizar experimentos siguiendo un protocolo de Hanahan modificado utilizando cloruro de calcio en E. coli, se determinó que los esferoplastos pueden transformarse a 4,9x10⁻⁴.