Enzima restrictiva

Una enzima de restricción, endonucleasa de restricción, REasa, ENasa o restrictasa< /b> es una enzima que divide el ADN en fragmentos en o cerca de sitios de reconocimiento específicos dentro de moléculas conocidas como sitios de restricción. Las enzimas de restricción son una clase del grupo más amplio de enzimas endonucleasas. Las enzimas de restricción se clasifican comúnmente en cinco tipos, que difieren en su estructura y si cortan su sustrato de ADN en su sitio de reconocimiento, o si los sitios de reconocimiento y división están separados entre sí. Para cortar el ADN, todas las enzimas de restricción hacen dos incisiones, una a través de cada esqueleto de azúcar-fosfato (es decir, cada hebra) de la doble hélice del ADN.

Estas enzimas se encuentran en bacterias y arqueas y proporcionan un mecanismo de defensa contra los virus invasores. Dentro de un procariota, las enzimas de restricción cortan selectivamente el ADN extraño en un proceso llamado digestión de restricción; mientras tanto, el ADN del huésped está protegido por una enzima de modificación (una metiltransferasa) que modifica el ADN procariótico y bloquea la escisión. Juntos, estos dos procesos forman el sistema de modificación de restricciones.

Se conocen más de 3600 endonucleasas de restricción que representan más de 250 especificidades diferentes. Se han estudiado en detalle más de 3000 de estos, y más de 800 están disponibles comercialmente. Estas enzimas se utilizan habitualmente para la modificación del ADN en los laboratorios y son una herramienta vital en la clonación molecular.

Historia

El término enzima de restricción se originó a partir de los estudios del fago λ, un virus que infecta bacterias, y el fenómeno de restricción y modificación controlada por el huésped de dicho fago o bacteriófago bacteriano. El fenómeno se identificó por primera vez en trabajos realizados en los laboratorios de Salvador Luria, Jean Weigle y Giuseppe Bertani a principios de la década de 1950. Se encontró que, para un bacteriófago λ que puede crecer bien en una cepa de Escherichia coli, por ejemplo E. coli C, cuando se cultiva en otra cepa, por ejemplo E. coli K, sus rendimientos pueden caer significativamente, hasta en 3-5 órdenes de magnitud. La célula huésped, en este ejemplo E. coli K, se conoce como huésped restrictivo y parece tener la capacidad de reducir la actividad biológica del fago λ. Si un fago se establece en una cepa, la capacidad de crecimiento de ese fago también se restringe en otras cepas. En la década de 1960, se demostró en el trabajo realizado en los laboratorios de Werner Arber y Matthew Meselson que la restricción es causada por una escisión enzimática del ADN del fago y, por lo tanto, la enzima involucrada se denominó enzima de restricción.

Las enzimas de restricción estudiadas por Arber y Meselson eran enzimas de restricción de tipo I, que separan el ADN aleatoriamente del sitio de reconocimiento. En 1970, Hamilton O. Smith, Thomas Kelly y Kent Wilcox aislaron y caracterizaron la primera enzima de restricción tipo II, HindII, de la bacteria Haemophilus influenzae. Las enzimas de restricción de este tipo son más útiles para el trabajo de laboratorio, ya que escinden el ADN en el sitio de su secuencia de reconocimiento y son las más utilizadas como herramienta de biología molecular. Más tarde, Daniel Nathans y Kathleen Danna demostraron que la escisión del ADN del virus simio 40 (SV40) por enzimas de restricción produce fragmentos específicos que se pueden separar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, lo que demuestra que las enzimas de restricción también se pueden usar para mapear el ADN. Por su trabajo en el descubrimiento y caracterización de las enzimas de restricción, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1978 fue otorgado a Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton O. Smith. El descubrimiento de las enzimas de restricción permite manipular el ADN, lo que lleva al desarrollo de tecnología de ADN recombinante que tiene muchas aplicaciones, por ejemplo, permite la producción a gran escala de proteínas como la insulina humana utilizada por pacientes diabéticos.

Orígenes

Las enzimas de restricción probablemente evolucionaron a partir de un ancestro común y se generalizaron a través de la transferencia horizontal de genes. Además, cada vez hay más pruebas de que las endonucleasas de restricción evolucionaron como un elemento genético egoísta.

Sitio de reconocimiento

Un sitio de reconocimiento palindrómico lee lo mismo en el hilo inverso que en el hilo delantero cuando ambos se leen en la misma orientación

Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica de nucleótidos y producen un corte de doble cadena en el ADN. Las secuencias de reconocimiento también se pueden clasificar por el número de bases en su sitio de reconocimiento, generalmente entre 4 y 8 bases, y el número de bases en la secuencia determinará con qué frecuencia aparecerá el sitio por casualidad en cualquier genoma dado, por ejemplo, un La secuencia de 4 pares de bases ocurriría teóricamente una vez cada 4^4 o 256 pb, 6 bases, 4^6 o 4096 pb, y 8 bases serían 4^8 o 65536 pb. Muchos de ellos son palindrómicos, lo que significa que la secuencia base se lee igual hacia adelante y hacia atrás. En teoría, hay dos tipos de secuencias palindrómicas que pueden ser posibles en el ADN. El palíndromo en forma de espejo es similar a los que se encuentran en el texto ordinario, en el que una secuencia se lee igual hacia adelante y hacia atrás en una sola hebra de ADN, como en GTAATG. El palíndromo de repetición invertida también es una secuencia que se lee igual hacia adelante y hacia atrás, pero las secuencias hacia adelante y hacia atrás se encuentran en cadenas de ADN complementarias (es decir, de ADN de doble cadena), como en GTATAC (GTATAC siendo complementario a CATATG). Los palíndromos repetidos invertidos son más comunes y tienen mayor importancia biológica que los palíndromos en forma de espejo.

La digestión con EcoRI produce "pegajosas" termina,

Mientras que la escisión de la enzima de restricción SmaI produce "romo" termina:

Las secuencias de reconocimiento en el ADN difieren para cada enzima de restricción, lo que produce diferencias en la longitud, la secuencia y la orientación de la hebra (extremo 5' o extremo 3') de un extremo pegajoso 'que sobresale'. de una restricción enzimática.

Diferentes enzimas de restricción que reconocen la misma secuencia se conocen como neoesquizómeros. Estos a menudo se escinden en diferentes lugares de la secuencia. Las diferentes enzimas que reconocen y escinden en el mismo lugar se conocen como isosquizómeros.

Tipos

Las endonucleasas de restricción naturales se clasifican en cinco grupos (tipos I, II, III, IV y V) en función de su composición y requisitos de cofactor enzimático, la naturaleza de su secuencia objetivo y la posición relativa de su sitio de corte de ADN. a la secuencia objetivo. Sin embargo, el análisis de la secuencia de ADN de las enzimas de restricción muestra grandes variaciones, lo que indica que hay más de cuatro tipos. Todos los tipos de enzimas reconocen secuencias cortas de ADN específicas y llevan a cabo la escisión endonucleolítica del ADN para dar fragmentos específicos con 5'-fosfatos terminales. Difieren en su secuencia de reconocimiento, composición de subunidades, posición de división y requisitos de cofactores, como se resume a continuación:

• Enzimas tipo I (EC 3.1.21.3) se liberan en sitios remotos de un sitio de reconocimiento; requieren tanto ATP como S-adenosyl-L-metionina para funcionar; proteína multifuncional con digestión de restricción y metilas (EC 2.1.1.72).
• Enzimas tipo II (EC 3.1.21.4) se liberan dentro o a corta distancias específicas de un sitio de reconocimiento; la mayoría requieren magnesio; enzimas de función única (digestión de restricción) independientes de metilas.
• Las enzimas tipo III (EC 3.1.21.5) se extienden a sitios a corta distancia de un sitio de reconocimiento; requieren ATP (pero no hidrolizarla); S-adenosyl-L-metionina estimula la reacción pero no es necesaria; existen como parte de un complejo con una modificación de metilas (EC 2.1.1.72).
• enzimas tipo IV apuntan ADN modificado, por ejemplo ADN metilado, hidroximetilado y glucosilhidroximetilado
• Enzimas tipo V utilizan ARN guía (gRNAs)

Tipo l

Las enzimas de restricción de tipo I fueron las primeras en identificarse y se identificaron por primera vez en dos cepas diferentes (K-12 y B) de E. coli. Estas enzimas cortan en un sitio que difiere y está a una distancia aleatoria (al menos 1000 pb) de su sitio de reconocimiento. La escisión en estos sitios aleatorios sigue un proceso de translocación de ADN, lo que demuestra que estas enzimas también son motores moleculares. El sitio de reconocimiento es asimétrico y se compone de dos porciones específicas, una que contiene de 3 a 4 nucleótidos y otra de 4 a 5 nucleótidos, separadas por un espaciador no específico de aproximadamente 6 a 8 nucleótidos. Estas enzimas son multifuncionales y son capaces de realizar actividades tanto de digestión de restricción como de modificación, dependiendo del estado de metilación del ADN diana. Los cofactores S-adenosil metionina (AdoMet), trifosfato de adenosina hidrolizado (ATP) y iones de magnesio (Mg²⁺) son necesarios para su plena actividad. Las enzimas de restricción de tipo I poseen tres subunidades denominadas HsdR, HsdM y HsdS; Se requiere HsdR para la digestión de restricción; HsdM es necesario para agregar grupos metilo al ADN huésped (actividad de metiltransferasa), y HsdS es importante para la especificidad del sitio de reconocimiento (unión de ADN) además de la actividad de digestión de restricción (escisión de ADN) y modificación (ADN metiltransferasa).

Tipo II

Las enzimas de restricción típicas de tipo II difieren de las enzimas de restricción de tipo I en varios aspectos. Forman homodímeros, con sitios de reconocimiento que suelen ser indivisos y palindrómicos y de 4 a 8 nucleótidos de longitud. Reconocen y escinden el ADN en el mismo sitio y no utilizan ATP ni AdoMet para su actividad; por lo general, solo requieren Mg²⁺ como cofactor. Estas enzimas rompen el enlace fosfodiéster del ADN de doble hélice. Puede dividirse en el centro de ambas hebras para producir un extremo romo, o en una posición escalonada dejando salientes llamados extremos pegajosos. Estas son las enzimas de restricción más comúnmente disponibles y utilizadas. En la década de 1990 y principios de la década de 2000, se descubrieron nuevas enzimas de esta familia que no seguían todos los criterios clásicos de esta clase de enzimas, y se desarrolló una nueva nomenclatura de subfamilias para dividir esta gran familia en subcategorías en función de las desviaciones de las características típicas de las enzimas de tipo II.. Estos subgrupos se definen mediante un sufijo de letra.

Las enzimas de restricción de tipo IIB (p. ej., BcgI y BplI) son multímeros que contienen más de una subunidad. Cortan el ADN en ambos lados de su reconocimiento para cortar el sitio de reconocimiento. Requieren los cofactores AdoMet y Mg²⁺. Las endonucleasas de restricción de tipo IIE (p. ej., NaeI) escinden el ADN después de la interacción con dos copias de su secuencia de reconocimiento. Un sitio de reconocimiento actúa como el objetivo de la escisión, mientras que el otro actúa como un efector alostérico que acelera o mejora la eficiencia de la escisión enzimática. Al igual que las enzimas de tipo IIE, las endonucleasas de restricción de tipo IIF (p. ej., NgoMIV) interactúan con dos copias de su secuencia de reconocimiento, pero escinden ambas secuencias al mismo tiempo. Las endonucleasas de restricción de tipo IIG (p. ej., RM.Eco57I) tienen una sola subunidad, como las enzimas de restricción de tipo II clásicas, pero requieren que el cofactor AdoMet esté activo. Las endonucleasas de restricción de tipo IIM, como DpnI, pueden reconocer y cortar el ADN metilado. Las endonucleasas de restricción de tipo IIS (p. ej., FokI) escinden el ADN a una distancia definida de sus sitios de reconocimiento asimétricos no palindrómicos; esta característica es muy utilizada para realizar técnicas de clonación in vitro como la clonación Golden Gate. Estas enzimas pueden funcionar como dímeros. De manera similar, las enzimas de restricción de tipo IIT (p. ej., Bpu10I y BslI) se componen de dos subunidades diferentes. Algunos reconocen secuencias palindrómicas mientras que otros tienen sitios de reconocimiento asimétricos.

Tipo III

Las enzimas de restricción de tipo III (p. ej., EcoP15) reconocen dos secuencias no palindrómicas separadas que están inversamente orientadas. Cortan el ADN entre 20 y 30 pares de bases después del sitio de reconocimiento. Estas enzimas contienen más de una subunidad y requieren cofactores AdoMet y ATP para sus funciones en la metilación del ADN y la digestión de restricción, respectivamente. Son componentes de los mecanismos de restricción-modificación del ADN procariótico que protegen al organismo contra la invasión de ADN extraño. Las enzimas de tipo III son proteínas multifuncionales heterooligoméricas compuestas por dos subunidades, Res (P08764) y Mod (P08763). La subunidad Mod reconoce la secuencia de ADN específica del sistema y es una metiltransferasa modificada; como tal, es funcionalmente equivalente a las subunidades M y S de la endonucleasa de restricción tipo I. La res es necesaria para la digestión de restricción, aunque no tiene actividad enzimática por sí sola. Las enzimas de tipo III reconocen secuencias de ADN asimétricas cortas de 5 a 6 pb de longitud y escinden 25 a 27 pb aguas abajo para dejar cadenas cortas de 5' protuberancias Requieren la presencia de dos sitios de reconocimiento no metilados orientados inversamente para que ocurra la digestión de restricción. Estas enzimas metilan solo una hebra del ADN, en la posición N-6 de los residuos de adenosilo, por lo que el ADN recién replicado tendrá solo una hebra metilada, lo que es suficiente para proteger contra la digestión por restricción. Las enzimas de tipo III pertenecen a la subfamilia beta de las adenina metiltransferasas N6 y contienen los nueve motivos que caracterizan a esta familia, incluido el motivo I, el bolsillo de unión de AdoMet (FXGXG) y el motivo IV, la región catalítica (S/D/N (PP) S/F).

Tipo IV

Las enzimas de tipo IV reconocen el ADN modificado, normalmente metilado, y se ejemplifican en los sistemas McrBC y Mrr de E. coli.

Tipo V

Las enzimas de restricción de tipo V (p. ej., el complejo cas9-gRNA de CRISPR) utilizan ARN guía para dirigirse a secuencias no palindrómicas específicas que se encuentran en los organismos invasores. Pueden cortar ADN de longitud variable, siempre que se proporcione un ARN guía adecuado. La flexibilidad y la facilidad de uso de estas enzimas las hacen prometedoras para futuras aplicaciones de ingeniería genética.

Enzimas de restricción artificiales

Las enzimas de restricción artificiales se pueden generar mediante la fusión de un dominio de unión al ADN natural o diseñado con un dominio de nucleasa (a menudo, el dominio de escisión de la enzima de restricción tipo IIS FokI). Tales enzimas de restricción artificiales pueden dirigirse a sitios de ADN grandes (hasta 36 pb) y pueden diseñarse para unirse a las secuencias de ADN deseadas. Las nucleasas con dedos de zinc son las enzimas de restricción artificiales más comúnmente utilizadas y generalmente se usan en aplicaciones de ingeniería genética, pero también se pueden usar para aplicaciones de clonación de genes más estándar. Otras enzimas de restricción artificiales se basan en el dominio de unión al ADN de los efectores TAL.

En 2013, se diseñó una nueva tecnología CRISPR-Cas9, basada en un sistema de defensa viral procariótico, para editar el genoma, y se adoptó rápidamente en los laboratorios. Para obtener más detalles, lea CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas).

En 2017, un grupo de la Universidad de Illinois informó sobre el uso de una proteína Argonaute extraída de Pyrococcus furiosus (PfAgo) junto con ADN guía para editar ADN in vitro como restricción artificial. enzimas

También se han desarrollado ribonucleasas artificiales que actúan como enzimas de restricción para el ARN. Un sistema basado en PNA, llamado PNAzima, tiene un grupo Cu(II)-2,9-dimetilfenantrolina que imita a las ribonucleasas para una secuencia de ARN específica y se escinde en una región sin pares de bases (protuberancia de ARN) del ARN objetivo formado cuando la enzima se une al ARN. Esta enzima muestra selectividad al escindir solo en un sitio que no tiene un desajuste o es cinéticamente preferido entre dos posibles sitios de escisión.

Nomenclatura

Desde su descubrimiento en la década de 1970, se han identificado muchas enzimas de restricción; por ejemplo, se han caracterizado más de 3500 enzimas de restricción Tipo II diferentes. Cada enzima lleva el nombre de la bacteria de la que se aisló, utilizando un sistema de denominación basado en el género, la especie y la cepa bacterianos. Por ejemplo, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se derivó como se muestra en el recuadro.

Aplicaciones

Las enzimas de restricción aisladas se utilizan para manipular el ADN para diferentes aplicaciones científicas.

Se utilizan para ayudar a la inserción de genes en vectores de plásmidos durante los experimentos de clonación de genes y producción de proteínas. Para un uso óptimo, los plásmidos que se usan comúnmente para la clonación de genes se modifican para incluir una secuencia polienlazador corta (llamada sitio de clonación múltiple o MCS) rica en secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. Esto permite flexibilidad al insertar fragmentos de genes en el vector de plásmido; los sitios de restricción contenidos naturalmente dentro de los genes influyen en la elección de la endonucleasa para digerir el ADN, ya que es necesario evitar la restricción del ADN deseado mientras se cortan intencionalmente los extremos del ADN. Para clonar un fragmento de gen en un vector, tanto el ADN del plásmido como el inserto del gen generalmente se cortan con las mismas enzimas de restricción y luego se unen con la ayuda de una enzima conocida como ADN ligasa.

Las enzimas de restricción también se pueden usar para distinguir los alelos de genes mediante el reconocimiento específico de cambios de una sola base en el ADN conocidos como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Sin embargo, esto solo es posible si un SNP altera el sitio de restricción presente en el alelo. En este método, la enzima de restricción se puede utilizar para genotipificar una muestra de ADN sin necesidad de una costosa secuenciación de genes. La muestra se digiere primero con la enzima de restricción para generar fragmentos de ADN, y luego los fragmentos de diferentes tamaños se separan mediante electroforesis en gel. En general, los alelos con sitios de restricción correctos generarán dos bandas visibles de ADN en el gel, y aquellos con sitios de restricción alterados no se cortarán y generarán solo una banda. También se puede generar un mapa de ADN por digestión de restricción que puede dar las posiciones relativas de los genes. Las diferentes longitudes de ADN generadas por digestión de restricción también producen un patrón específico de bandas después de la electroforesis en gel y pueden usarse para la toma de huellas dactilares de ADN.

De manera similar, las enzimas de restricción se utilizan para digerir el ADN genómico para el análisis de genes mediante transferencia de Southern. Esta técnica permite a los investigadores identificar cuántas copias (o parálogos) de un gen están presentes en el genoma de un individuo, o cuántas mutaciones genéticas (polimorfismos) se han producido dentro de una población. El último ejemplo se denomina polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP).

Las enzimas de restricción artificiales creadas al vincular el dominio de escisión del ADN FokI con una matriz de proteínas de unión al ADN o matrices de dedos de zinc, denominadas nucleasas de dedos de zinc (ZFN), son una herramienta poderosa para la edición del genoma del huésped. debido a su mayor especificidad de secuencia. ZFN trabaja en pares, siendo mediada su dimerización in situ a través del dominio FokI. Cada matriz de dedos de zinc (ZFA) es capaz de reconocer de 9 a 12 pares de bases, lo que da como resultado 18 a 24 para el par. Un espaciador de 5 a 7 pb entre los sitios de división mejora aún más la especificidad de ZFN, lo que los convierte en una herramienta segura y más precisa que se puede aplicar en humanos. Se ha llevado a cabo un ensayo clínico de fase I reciente de ZFN para la abolición dirigida del correceptor CCR5 para el VIH-1.

Otros han propuesto utilizar el sistema bacteriano R-M como modelo para diseñar vacunas y terapias genómicas o génicas antivirales humanas, ya que el sistema RM cumple una función de defensa innata en las bacterias al restringir el tropismo de los bacteriófagos. Hay investigaciones sobre REasas y ZFN que pueden escindir el ADN de varios virus humanos, incluido el HSV-2, los VPH de alto riesgo y el VIH-1, con el objetivo final de inducir mutagénesis objetivo y aberraciones de virus que infectan a humanos. El genoma humano ya contiene restos de genomas retrovirales que han sido inactivados y aprovechados para beneficio propio. De hecho, los mecanismos para silenciar los retroelementos genómicos L1 activos mediante la exonucleasa 1 de tres reparaciones principales (TREX1) y la complementación cruzada 1 de reparación por escisión (ERCC) parecen imitar la acción de los sistemas RM en bacterias y la unión final no homóloga (NHEJ) que sigue al uso de ZFN sin plantilla de reparación.

Ejemplos

Ejemplos de enzimas de restricción incluyen:

5'GAATTC
3'CTTAAG

5'---G AATTC---3 '
3'---CTTAA G---5 '

5'CCWGG
3'GGWCC

5'... CCWGG---3 '
3'---GGWCC ---5 '

5'GGATCC
3'CCTAGG

5'---G GATCC---3 '
3'---CCTAG G---5 '

5'AAGCTT
3'TTCGAA

5'---A AGCTT---3 '
3'---TTCGA A---5 '

5'TCGA
3'AGCT

5'---T CGA---3 '
3'---AGC T---5 '

5'GCGCCGC
3'CGCCGGCG

5'---GC GGCCGC---3 '
3'---CGCCG CG---5 '

5'GANTC
3'CTNAG

5'---G ANTC---3 '
3'--- CTNA G---5 '

5'GATC
3'CTAG

5'... GATC...-3 '
3'---CTAG ---5 '

5'CAGCTG
3'GTCGAC

5'---CAG CTG---3 '
3'---GTC GAC---5 '

5'CCCGG
3'GGGCCC

5'---CCC GGG---3 '
3'---GGG CCC---5 '

5'GGCC
3'CCG

5'---GG CC---3 '
3'---CC GG---5 '

5'GACGC
3'CTGCG

5'... NN NN...-3 '
3'... NNN...-5 '

5'AGCT
3'TCGA

5'---AG CT---3 '
3'---TC GA---5 '

5'GATATC
3'CTATAG

5'---GAT ATC---3 '
3'---CTA TAG---5 '

5'CAGCAGN25NN
3'GTCGTCN25NN

5'---CAGCAGN25 NN...-3 '
3'---GTCGTCN25NN-5 '

5'GGTACC
3'CCATG

5'---GGGTAC C---3 '
3'-C CATGG--5 '

5'CTGCAG
3'GACGTC

5'---CTGCA G---3 '
3'---G ACGTC---5 '

5'GAGCTC
3'CTCGAG

5'---GAGCT C---3 '
3'-C TCGAG---5 '

5'GTCGAC
3'CAGCTG

5'---G TCGAC---3 '
3'---CAGCT G---5 '

5'AGTACT
3'TCATGA

5'---AGT ACT---3 '
3'---TCA TGA---5 '

5'ACTAGT
3'TGATCA

5'---Un CTAGT---3 '
3'---TGATC A---5 '

5'GCATGC
3'CG

5'---GCATG C---3 '
3'-C GTACG---5 '

5'AGGCCT
3'TCCGGA

5'---AGG CCT---3 '
3'---TCC GGA---5 '

5'TCTAGA
3'AGATCT

5'---T CTAGA---3 '
3'---AGATC T---5 '

Clave:
* = extremos romos
N = C o G o T o A
W = A o T