Ensayo de cambio de movilidad electroforética.

Un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) o electroforesis por cambio de movilidad, también conocido como ensayo de cambio de gel, gel de movilidad El ensayo de desplazamiento, el ensayo de desplazamiento de banda o el ensayo de retardo en gel es una técnica de electroforesis de afinidad común que se utiliza para estudiar las interacciones proteína-ADN o proteína-ARN. Este procedimiento puede determinar si una proteína o mezcla de proteínas es capaz de unirse a una secuencia de ADN o ARN determinada y, en ocasiones, puede indicar si más de una molécula de proteína está involucrada en el complejo de unión. Los ensayos de cambio de gel a menudo se realizan in vitro al mismo tiempo que la huella de ADNasa, la extensión del cebador y los experimentos de sonda promotora cuando se estudia el inicio de la transcripción, la replicación de bandas de ADN, la reparación del ADN o el procesamiento y maduración del ARN, así como el empalme del pre-ARNm. Aunque se pueden encontrar precursores en la literatura anterior, la mayoría de los ensayos actuales se basan en métodos descritos por Garner y Revzin y Fried y Crothers.

Principio

Un ensayo de cambio de movilidad es la separación electroforética de una mezcla de proteína-ADN o proteína-ARN en un gel de poliacrilamida o agarosa durante un período corto (alrededor de 1,5 a 2 horas para un gel de 15 a 20 cm). La velocidad a la que las diferentes moléculas (y combinaciones de ellas) se mueven a través del gel está determinada por su tamaño y carga y, en menor medida, por su forma (ver electroforesis en gel). El carril de control (sonda de ADN sin proteína presente) contendrá una única banda correspondiente al fragmento de ADN o ARN no unido. Sin embargo, suponiendo que la proteína sea capaz de unirse al fragmento, el carril con una proteína que se une contendrá otra banda que representa el complejo más grande y menos móvil de la sonda de ácido nucleico unida a la proteína que está "desplazada". ; encima del gel (ya que se ha movido más lentamente).

Bajo las condiciones experimentales correctas, la interacción entre el ADN (o ARN) y la proteína se estabiliza y la proporción de ácido nucleico unido a no unido en el gel refleja la fracción de moléculas sonda libres y unidas a medida que la reacción de unión ingresa al gel. . Esta estabilidad se debe en parte a un "efecto de jaula", en el que la proteína, rodeada por la matriz de gel, no puede difundirse fuera de la sonda antes de recombinarse. Si se conocen las concentraciones iniciales de proteína y sonda, y si se conoce la estequiometría del complejo, se puede determinar la afinidad aparente de la proteína por la secuencia de ácido nucleico. A menos que el complejo tenga una vida muy larga en condiciones de gel, o se tenga en cuenta la disociación durante la electroforesis, el número obtenido es una Kd aparente. Si no se conoce la concentración de proteína pero sí la estequiometría compleja, la concentración de proteína se puede determinar aumentando la concentración de la sonda de ADN hasta que incrementos adicionales no aumenten la fracción de proteína unida. En comparación con un conjunto de diluciones estándar de sonda libre aplicadas en el mismo gel, se puede calcular el número de moles de proteína.

Variantes y añadidos

Se puede agregar un anticuerpo que reconoce la proteína a esta mezcla para crear un complejo aún más grande con un cambio mayor. Este método se conoce como ensayo de superdesplazamiento y se utiliza para identificar sin ambigüedades una proteína presente en el complejo proteína-ácido nucleico.

A menudo, se ejecuta un carril adicional con un oligonucleótido competidor para determinar la secuencia de unión más favorable para la proteína de unión. El uso de diferentes oligonucleótidos de secuencia definida permite la identificación del sitio de unión preciso mediante competición (no mostrado en el diagrama). Las variantes del ensayo de competición son útiles para medir la especificidad de unión y para medir la cinética de asociación y disociación. Por lo tanto, EMSA también podría usarse como parte de un experimento SELEX para seleccionar oligonucleótidos que realmente se unen a una proteína determinada.

Una vez que se determina la unión entre el ADN y la proteína in vitro, varios algoritmos pueden limitar la búsqueda de identificación del factor de transcripción. Los oligonucleótidos de secuencia de consenso para el factor de transcripción de interés podrán competir por la unión, eliminando la banda desplazada, y deben confirmarse mediante supershift. Si la secuencia consenso predicha no logra competir por la unión, la identificación del factor de transcripción puede ser ayudada por EMSA Competidor Multiplexado (MC-EMSA), mediante el cual grandes conjuntos de secuencias consenso se multiplexan en cada reacción, y cuando un conjunto compite por la unión, el Las secuencias de consenso individuales de este conjunto se ejecutan en una reacción adicional.

Para fines de visualización, el fragmento de ácido nucleico generalmente se marca con una etiqueta radiactiva, fluorescente o de biotina. La tinción estándar con bromuro de etidio es menos sensible que estos métodos y puede carecer de la sensibilidad necesaria para detectar el ácido nucleico si en estos experimentos se utilizan pequeñas cantidades de ácido nucleico o de ácidos nucleicos monocatenarios. Cuando se utiliza un marcador de biotina, se utiliza estreptavidina conjugada con una enzima como la peroxidasa de rábano picante para detectar el fragmento de ADN. Si bien el marcaje isotópico del ADN tiene poco o ningún efecto sobre la afinidad de unión a proteínas, el uso de marcadores no isotópicos, incluidos fluoróforos o biotina, puede alterar la afinidad y/o la estequiometría de la interacción proteica de interés. Se puede utilizar la competencia entre la sonda marcada con fluoróforo o biotina y el ADN no marcado de la misma secuencia para determinar si el marcador altera la afinidad de unión o la estequiometría.