Ensayo de ácido bicinconínico

El ensayo del ácido bicinconínico (ensayo BCA), también conocido como ensayo de Smith, en honor a su inventor, Paul K. Smith en el Pierce Chemical Company, ahora parte de Thermo Fisher Scientific, es un ensayo bioquímico para determinar la concentración total de proteína en una solución (0,5 μg/mL a 1,5 mg/mL), similar al ensayo de proteínas de Lowry, el ensayo de proteínas de Bradford o el reactivo de biuret. La concentración total de proteínas se manifiesta mediante un cambio de color de la solución de muestra de azul a púrpura en proporción a la concentración de proteínas, que luego puede medirse mediante técnicas colorimétricas. El ensayo BCA fue patentado por Pierce Chemical Company en 1989 y 2000. la patente expiró en 2006.

Mecanismo

Una solución madre de BCA contiene los siguientes ingredientes en una solución altamente alcalina con un pH de 11,25: ácido bicinconínico, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, tartrato de sodio y sulfato de cobre (II) pentahidratado.

El ensayo BCA se basa principalmente en dos reacciones. En primer lugar, los enlaces peptídicos de las proteínas reducen los iones Cu²⁺ del sulfato de cobre (II) a Cu¹⁺ (una reacción que depende de la temperatura). La cantidad de Cu²⁺ reducida es proporcional a la cantidad de proteína presente en la solución. A continuación, dos moléculas de ácido bicinconínico se quelan con cada ion Cu¹⁺, formando un complejo de color púrpura que absorbe fuertemente la luz a una longitud de onda de 562 nm.

El complejo de ácido bicinconínico Cu¹⁺ está influenciado en muestras de proteínas por la presencia de cadenas laterales de cisteína/cistina, tirosina y triptófano. A temperaturas más altas (37 a 60 °C), los enlaces peptídicos ayudan en la formación del complejo de reacción. Se recomienda incubar el ensayo BCA a temperaturas más altas como una forma de aumentar la sensibilidad del ensayo y al mismo tiempo minimizar las variaciones causadas por la composición desigual de aminoácidos.

La cantidad de proteína presente en una solución se puede cuantificar midiendo los espectros de absorción y comparándolos con soluciones de proteínas de concentración conocida.

Limitaciones

El ensayo BCA es en gran medida incompatible con agentes reductores y quelantes de metales, aunque se pueden tolerar cantidades mínimas. Según se informa, el ensayo BCA también responde a los lípidos y fosfolípidos de membrana comunes.

Variantes de ensayo

Existen algunas variantes alternativas del ensayo BCA:

Ensayo BCA original

Como lo describe Smith, el ensayo BCA original es un protocolo de dos componentes. Los dos reactivos son "estables indefinidamente a temperatura ambiente". Hay formulaciones modernas (probablemente exactas o muy similares) disponibles de al menos dos proveedores comerciales. La solución de trabajo BCA se genera mezclando el reactivo A y el reactivo B en una proporción de 50:1 y se puede preparar semanalmente (es moderadamente estable) o según sea necesario.

Reactivo A

• 1% w/v BCA-Na2 (CAS: 979-88-4)
• 2% w/v Na2CO3·H2O (CAS: 5968-11-6)
• 0.16% w/v Na2 tartrate (CAS: 868-18-8)
• 0,4% w/v NaOH (CAS: 1310-73-2)
• 0,95% w/v NaHCO3 (CAS: 144-55-8)
• Añadir 50% NaOH o sólido NaHCO3 para ajustar el pH a 11.25

Una formulación alternativa sugerida pero no probada en el manuscrito de Smith es omitir el NaOH (y presumiblemente no realizar el ajuste manual del pH a 11,25), sino disolver los otros componentes en un tampón preparado previamente de Na 0,25 M ₂CO₃ y NaHCO₃ 0,01 M.

En particular, Smith sintetizó su propio BCA mediante la reacción de Pfitzinger de isatina y acetoína, sustituyendo KOH por NaOH pero siguiendo el método sintético de Lesene y Henze, ya que el BCA disponible de los proveedores comerciales de esa época era demasiado impuro para su uso. . Se necesitaron al menos tres recristalizaciones sucesivas de su BCA sintetizado en agua a 70 °C para purificarlo lo suficiente para el ensayo.

Reactivo B

• 4% w/v CuSO4·5H2O

Ensayo Micro BCA (para soluciones diluidas)

El ensayo BCA Micro BCA es un protocolo de 3 componentes que utiliza reservas concentradas de reactivos de reacción de Biuret, BCA y cobre (II). Permite una sensibilidad mejorada de ~2 - 40 μg/mL frente a 20 - 2000 μg/mL del ensayo BCA original. Sin embargo, tiene una interferencia diferente, y en general más sensible, de los componentes no proteicos. Los kits para el ensayo Micro BCA están disponibles en al menos dos proveedores comerciales. En particular, la composición y el uso de un "Reactivo y protocolo Micro BCA" fue descrito en el manuscrito original de Smith, y los kits modernos probablemente constan de una formulación exacta o muy similar. El protocolo consiste en mezclar el Micro-Reactivo B y la Solución de Cobre 25:1 para formar el Micro-Reactivo C (MC), que no es estable y debe estar recién preparado, y luego mezclar MC 1:1 con el Micro-Reactivo A para producir la solución de trabajo del ensayo final (también inestable). El microreactivo A, el microreactivo B y la solución de cobre son estables indefinidamente a temperatura ambiente.

Microreactivo A (MA)

• 8% w/v Na2CO3·H2O (CAS: 5968-11-6)
• 1.6% w/v NaOH (CAS: 1310-73-2)
• 1.6% w/v Na2 tartrate (CAS: 868-18-8) (10x concentration as Reagent A in Original BCA Assay above)
• Suficiente NaHCO3 (CAS: 144-55-8) para ajustar pH a 11.25

Microreactivo B (MB)

• 4% w/v BCA-Na2 (CAS: 979-88-4) Concentración (4x como agente A en el ensayo original de BCA anterior)

Solución de cobre

• 4% w/v CuSO4·5H2O (CAS: 7758-99-8) (La misma concentración como agente B en el ensayo original de BCA anterior)

Ensayo de BSA compatible con agente reductor (RAC)

Este tipo de ensayo BCA incluye un bloque covalente tiol propietario "Compatibilidad Reagent" aka a Reducing Agent Compatibility Agent (RACA). Aunque esto permite una mayor compatibilidad con los agentes de reducción, el ensayo tiene un perfil de interferencia diferente de otros componentes no proteínas.

BCA de oro rápido

Este tipo de ensayo BCA parece estar disponible únicamente en Thermo Fisher Scientific. Según se informa, utiliza "el mismo método de reducción de cobre que el ensayo de proteína BCA tradicional con un quelante de cobre [patentado] único", que absorbe a 480 nm en lugar de 562 nm. Este quelante propietario y la formulación de reacción de Biuret presuntamente optimizada permiten que el ensayo proporcione resultados rápidos (<5 min) sin la incubación a 37 ˚C+ del ensayo BCA original. Sin embargo, el ensayo tiene un perfil de interferencia diferente al de otros componentes no proteicos. El ensayo de péptidos colorimétrico cuantitativo Pierce (ahora propiedad de Thermo Fisher Scientific y disponible en él) parece utilizar un quelante de cobre patentado con absorción de 480 nm similar o idéntico.