Empalme de ARN

El empalme de ARN, ayuste de ARN o splicing de ARN es un proceso de biología molecular en el que un transcrito de ARN mensajero precursor (pre-ARNm) recién creado se transforma en un ARN mensajero (ARNm) maduro. Funciona eliminando todos los intrones (regiones no codificantes del ARN) y empalmandovuelven a juntar los exones (regiones de codificación). Para los genes con codificación nuclear, el empalme ocurre en el núcleo durante o inmediatamente después de la transcripción. Para aquellos genes eucarióticos que contienen intrones, generalmente se necesita el empalme para crear una molécula de ARNm que pueda traducirse en proteína. Para muchos intrones eucariotas, el empalme ocurre en una serie de reacciones que son catalizadas por el spliceosoma, un complejo de pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP). Existen intrones de autoempalme, es decir, ribozimas que pueden catalizar su propia escisión de su molécula de ARN original. El proceso de transcripción, empalme y traducción se llama expresión génica, el dogma central de la biología molecular.

Caminos de empalme

Varios métodos de corte y empalme de ARN ocurren en la naturaleza; el tipo de empalme depende de la estructura del intrón empalmado y de los catalizadores necesarios para que se produzca el empalme.

Complejo esplicosomal

Intrones

La palabra intrón se deriva de los términos región intragénica e intracistrón, es decir, un segmento de ADN que se ubica entre dos exones de un gen. El término intrón se refiere tanto a la secuencia de ADN dentro de un gen como a la secuencia correspondiente en la transcripción de ARN sin procesar. Como parte de la vía de procesamiento del ARN, los intrones se eliminan mediante el empalme del ARN poco después o al mismo tiempo que la transcripción. Los intrones se encuentran en los genes de la mayoría de los organismos y muchos virus. Se pueden ubicar en una amplia gama de genes, incluidos los que generan proteínas, ARN ribosómico (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt).

Dentro de los intrones, se requiere un sitio donante (extremo 5' del intrón), un sitio de ramificación (cerca del extremo 3' del intrón) y un sitio aceptor (extremo 3' del intrón) para el empalme. El sitio donante de corte y empalme incluye una secuencia GU casi invariable en el extremo 5' del intrón, dentro de una región más grande y menos conservada. El sitio aceptor de corte y empalme en el extremo 3' del intrón termina el intrón con una secuencia AG casi invariable. Aguas arriba (hacia 5') del AG hay una región alta en pirimidinas (C y U) o tramo de polipirimidina. Más arriba del tracto de polipirimidina está el punto de ramificación, que incluye un nucleótido de adenina involucrado en la formación de lazo.La secuencia de consenso para un intrón (en la notación de ácido nucleico de la IUPAC) es: GG-[corte]-GURAGU (sitio donante)... secuencia del intrón... YURAC (secuencia ramificada 20-50 nucleótidos aguas arriba del sitio aceptor)... Y-rico-NCAG-[corte]-G (sitio aceptor). Sin embargo, se observa que la secuencia específica de elementos de corte y empalme intrónicos y el número de nucleótidos entre el punto de ramificación y el sitio aceptor 3' más cercano afectan la selección del sitio de corte y empalme. Además, las mutaciones puntuales en el ADN subyacente o los errores durante la transcripción pueden activar un sitio de empalme críptico.en parte de la transcripción que normalmente no se empalma. Esto da como resultado un ARN mensajero maduro al que le falta una sección de un exón. De esta forma, una mutación puntual, que de otro modo podría afectar a un único aminoácido, puede manifestarse como una deleción o un truncamiento en la proteína final.

Ilustración simple de exones e intrones en pre-ARNm

Formación y actividad

El empalme es catalizado por el spliceosome, un gran complejo de proteína de ARN compuesto por cinco ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP). El ensamblaje y la actividad del spliceosoma ocurren durante la transcripción del pre-ARNm. Los componentes de ARN de las snRNP interactúan con el intrón y participan en la catálisis. Se han identificado dos tipos de spliceosomas (mayor y menor) que contienen diferentes snRNP.

• El spliceosoma principal empalma intrones que contienen GU en el sitio de empalme 5' y AG en el sitio de empalme 3'. Está compuesto por los snRNP U1, U2, U4, U5 y U6 y está activo en el núcleo. Además, se requieren varias proteínas, incluido el factor 1 auxiliar de ARN nuclear pequeño U2 (U2AF35), U2AF2 (U2AF65) y SF1, para el ensamblaje del empalmosoma. El spliceosoma forma diferentes complejos durante el proceso de empalme:

• Complejo E
  • La snRNP U1 se une a la secuencia GU en el sitio de corte y empalme 5' de un intrón;
  • El factor de empalme 1 se une a la secuencia del punto de ramificación del intrón;
  • U2AF1 se une al sitio de corte y empalme 3' del intrón;
  • U2AF2 se une al tracto de polipirimidina;

• Complejo A (pre-espliceosoma)
  • La snRNP U2 desplaza a SF1 y se une a la secuencia del punto de ramificación y se hidroliza ATP;

• Complejo B (spliceosoma precatalítico)
  • El trímero U5/U4/U6 snRNP se une, y el U5 snRNP se une a los exones en el sitio 5', con U6 uniéndose a U2;

• Complejo B*
  • Se libera la snRNP U1, U5 cambia de exón a intrón y U6 se une en el sitio de empalme 5';

• Complejo C (spliceosoma catalítico)
  • Se libera U4, U6/U2 cataliza la transesterificación, lo que hace que el extremo 5' del intrón se una con la A del intrón y forme un lazo, U5 se une al exón en el sitio de empalme 3' y el sitio 5' se escinde, lo que da como resultado la formación del lazo;

• Complejo C* (complejo post-espliceosoma)
  • U2/U5/U6 permanecen unidos al lazo, y el sitio 3' se escinde y los exones se ligan mediante hidrólisis de ATP. El ARN empalmado se libera, el lazo se libera y se degrada, y las snRNP se reciclan.

Este tipo de empalme se denomina empalme canónico o vía lariat, que representa más del 99% del empalme. Por el contrario, cuando las secuencias flanqueantes intrónicas no siguen la regla GU-AG, se dice que se produce empalme no canónico (ver "spliceosoma menor" a continuación).

• El spliceosoma menor es muy similar al spliceosoma mayor, pero en su lugar separa intrones raros con diferentes secuencias de sitios de empalme. Mientras que los spliceosomas menores y mayores contienen el mismo snRNP U5, el spliceosoma menor tiene snRNP diferentes pero funcionalmente análogos para U1, U2, U4 y U6, que se denominan respectivamente U11, U12, U4atac y U6atac.

Empalme recursivo

En la mayoría de los casos, el empalme elimina los intrones como unidades individuales de las transcripciones de ARNm precursor. Sin embargo, en algunos casos, especialmente en ARNm con intrones muy largos, el empalme ocurre en pasos, con parte de un intrón eliminado y luego el intrón restante se empalma en un paso siguiente. Esto se ha encontrado primero en el gen Ultrabithorax (Ubx) de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, y en algunos otros genes de Drosophila, pero también se han informado casos en humanos.

Empalme trans

El empalme trans es una forma de empalme que elimina intrones o outrones y une dos exones que no están dentro de la misma transcripción de ARN.

Auto-empalme

El auto-empalme ocurre para intrones raros que forman una ribozima, realizando las funciones del empalmesoma solo por ARN. Hay tres tipos de intrones de auto-empalme, Grupo I, Grupo II y Grupo III. Los intrones de los grupos I y II realizan un empalme similar al del spliceosoma sin necesidad de ninguna proteína. Esta similitud sugiere que los intrones del Grupo I y II pueden estar relacionados evolutivamente con el spliceosoma. El autoempalme también puede ser muy antiguo y puede haber existido en un mundo de ARN presente antes que la proteína.

Dos transesterificaciones caracterizan el mecanismo en el que se empalman los intrones del grupo I:

1. El 3'OH de un nucleósido de guanina libre (o uno ubicado en el intrón) o un cofactor de nucleótido (GMP, GDP, GTP) ataca al fosfato en el sitio de empalme 5'.
2. El 3'OH del exón 5' se convierte en un nucleófilo y la segunda transesterificación da como resultado la unión de los dos exones.

El mecanismo por el cual se empalman los intrones del grupo II (dos reacciones de transesterificación como los intrones del grupo I) es el siguiente:

1. El 2'OH de una adenosina específica en el intrón ataca el sitio de empalme 5', formando así el lazo.
2. El 3'OH del exón 5' desencadena la segunda transesterificación en el sitio de corte y empalme 3', uniendo así los exones.

Empalme de ARNt

El empalme de tRNA (también similar a tRNA) es otra forma rara de empalme que generalmente ocurre en tRNA. La reacción de empalme implica una bioquímica diferente a la de las vías de empalme y empalme propio.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, un heterotetrámero de endonucleasa de corte y empalme de ARNt de levadura, compuesto por TSEN54, TSEN2, TSEN34 y TSEN15, escinde el pre-ARNt en dos sitios en el bucle aceptor para formar un medio ARNt 5', que termina en 2', grupo fosfodiéster cíclico en 3' y medio ARNt en 3', que termina en un grupo hidroxilo en 5', junto con un intrón desechado. La quinasa de ARNt de levadura luego fosforila el grupo 5'-hidroxilo usando trifosfato de adenosina. La fosfodiesterasa cíclica de ARNt de levadura escinde el grupo fosfodiéster cíclico para formar un extremo 3' fosforilado en 2'. La ligasa de ARNt de levadura agrega un grupo monofosfato de adenosina al extremo 5' de la mitad 3' y une las dos mitades. Luego, la 2'-fosfotransferasa dependiente de NAD elimina el grupo 2'-fosfato.

Evolución

El empalme ocurre en todos los reinos o dominios de la vida, sin embargo, la extensión y los tipos de empalme pueden ser muy diferentes entre las divisiones principales. Los eucariotas empalman muchos ARN mensajeros que codifican proteínas y algunos ARN no codificantes. Los procariotas, por otro lado, empalman raramente y en su mayoría ARN no codificantes. Otra diferencia importante entre estos dos grupos de organismos es que los procariotas carecen por completo de la vía spliceosomal.

Debido a que los intrones spliceosomales no se conservan en todas las especies, existe un debate sobre cuándo evolucionó el empalme spliceosomal. Se han propuesto dos modelos: el intrón tardío y el intrón temprano (ver evolución del intrón).

	eucariotas	procariotas
esplicosomal	+	−
Auto-empalme	+	+
ARNt	+	+

Mecanismo bioquímico

El empalme y el autoempalme spliceosomal implican un proceso bioquímico de dos pasos. Ambos pasos involucran reacciones de transesterificación que ocurren entre nucleótidos de ARN. El empalme de tRNA, sin embargo, es una excepción y no ocurre por transesterificación.

Las reacciones de transesterificación de empalme y empalme automático se producen a través de dos reacciones de transesterificación secuenciales. Primero, el 2'OH de un nucleótido de punto de ramificación específico dentro del intrón, definido durante el ensamblaje del espliceosoma, realiza un ataque nucleofílico en el primer nucleótido del intrón en el sitio de empalme 5', formando el intermedio lariat. En segundo lugar, el 3'OH del exón 5' liberado realiza un ataque nucleofílico en el primer nucleótido que sigue al último nucleótido del intrón en el sitio de empalme 3', uniendo así los exones y liberando el intrón.

Splicing alternativo

En muchos casos, el proceso de empalme puede crear una variedad de proteínas únicas al variar la composición de exones del mismo ARNm. Este fenómeno se denomina empalme alternativo. El empalme alternativo puede ocurrir de muchas maneras. Los exones pueden extenderse u omitirse, o los intrones pueden retenerse. Se estima que el 95 % de las transcripciones de los genes multiexónicos se someten a cortes y empalmes alternativos, algunos de los cuales se producen de manera específica de tejido y/o en condiciones celulares específicas. El desarrollo de tecnología de secuenciación de ARNm de alto rendimiento puede ayudar a cuantificar los niveles de expresión de isoformas empalmadas alternativamente. Los niveles de expresión diferencial entre tejidos y linajes celulares permitieron desarrollar enfoques computacionales para predecir las funciones de estas isoformas. Dada esta complejidad, el empalme alternativo de las transcripciones de pre-ARNm está regulado por un sistema de proteínas que actúan en trans (activadores y represores) que se unen a los sitios que actúan en cis o "elementos" (potenciadores y silenciadores) en la propia transcripción de pre-ARNm. Estas proteínas y sus respectivos elementos de unión promueven o reducen el uso de un sitio de empalme particular. La especificidad de unión proviene de la secuencia y estructura de los elementos cis, por ejemplo, en el VIH-1 hay muchos sitios de empalme donantes y aceptores. Entre los diversos sitios de empalme, ssA7, que es el sitio aceptor 3', se pliega en tres estructuras de bucle de tallo, es decir, silenciador de empalme intrónico (ISS), potenciador de empalme exónico (ESE) y silenciador de empalme exónico (ESSE3).Sin embargo, añadiendo a la complejidad del empalme alternativo, se observa que los efectos de los factores reguladores muchas veces dependen de la posición. Por ejemplo, un factor de empalme que sirve como activador de empalme cuando se une a un elemento potenciador intrónico puede servir como represor cuando se une a su elemento de empalme en el contexto de un exón, y viceversa. Además de los efectos dependientes de la posición de los elementos potenciadores y silenciadores, la ubicación del punto de bifurcación (es decir, la distancia aguas arriba del sitio aceptor 3' más cercano) también afecta el empalme. La estructura secundaria de la transcripción de pre-ARNm también desempeña un papel en la regulación del empalme, por ejemplo, reuniendo elementos de empalme o enmascarando una secuencia que, de otro modo, serviría como elemento de unión para un factor de empalme.

Papel del empalme/empalme alternativo en la integración del VIH

El proceso de empalme está relacionado con la integración del VIH, ya que el VIH-1 se dirige a genes altamente empalmados.

Respuesta de empalme al daño del ADN

El daño en el ADN afecta a los factores de empalme al alterar su modificación, localización, expresión y actividad postraduccionales. Además, el daño del ADN a menudo interrumpe el empalme al interferir con su acoplamiento a la transcripción. El daño del ADN también tiene un impacto en el empalme y el empalme alternativo de genes íntimamente asociados con la reparación del ADN. Por ejemplo, los daños en el ADN modulan el empalme alternativo de los genes de reparación del ADN Brca1 y Ercc1.

Manipulación experimental de empalmes

Los eventos de empalme se pueden alterar experimentalmente uniendo oligos antisentido que bloquean estéricamente, como morfolinos o ácidos nucleicos peptídicos, a sitios de unión de snRNP, al nucleótido de punto de ramificación que cierra el lazo o a sitios de unión de elementos reguladores de empalme.

Errores de empalme y variación

Se ha sugerido que un tercio de todas las mutaciones causantes de enfermedades afectan el empalme. Los errores comunes incluyen:

• Mutación de un sitio de empalme que resulta en la pérdida de la función de ese sitio. Da como resultado la exposición de un codón de terminación prematuro, la pérdida de un exón o la inclusión de un intrón.
• Mutación de un sitio de empalme que reduce la especificidad. Puede resultar en una variación en la ubicación del empalme, provocando la inserción o eliminación de aminoácidos, o más probablemente, una interrupción del marco de lectura.
• Desplazamiento de un sitio de empalme, lo que lleva a la inclusión o exclusión de más ARN del esperado, lo que da como resultado exones más largos o más cortos.

Aunque muchos errores de empalme están protegidos por un mecanismo de control de calidad celular denominado descomposición del ARNm mediada por tonterías (NMD), también existen varias enfermedades relacionadas con el empalme, como se sugirió anteriormente.

Es probable que las diferencias alélicas en el empalme del ARNm sean una fuente común e importante de diversidad fenotípica a nivel molecular, además de su contribución a la susceptibilidad a enfermedades genéticas. De hecho, los estudios de todo el genoma en humanos han identificado una variedad de genes que están sujetos a empalmes específicos de alelos.

En las plantas, la variación de la tolerancia al estrés por inundaciones se correlacionó con el empalme alternativo inducido por el estrés de las transcripciones asociadas con la gluconeogénesis y otros procesos.

Empalme de proteínas

Además del ARN, las proteínas pueden sufrir empalmes. Aunque los mecanismos biomoleculares son diferentes, el principio es el mismo: se eliminan partes de la proteína, llamadas inteínas en lugar de intrones. Las partes restantes, llamadas exteínas en lugar de exones, se fusionan. El empalme de proteínas se ha observado en una amplia gama de organismos, incluidas bacterias, arqueas, plantas, levaduras y humanos.