Electroforesis en gel

La imagen anterior muestra cómo pequeños fragmentos de ADN migrarán a través de agarosa rápidamente pero los fragmentos de ADN de gran tamaño se mueven más lentamente durante la electroforesis. El gráfico a la derecha muestra la relación no lineal entre el tamaño del fragmento de ADN y la distancia migrada.

La electroforesis Gel es un proceso en el que se aplica una corriente eléctrica a las muestras de ADN creando fragmentos que pueden utilizarse para la comparación entre las muestras de ADN. El ADN se extrae. # Isolación y amplificación del ADN. ADN añadido a los pozos de gel. Corriente eléctrica aplicada al gel. # Las bandas de ADN están separadas por tamaño. # Las bandas de ADN están manchadas.

electroforesis en gel es un método de separación y análisis de biomacromoléculas (ADN, ARN, proteínas, etc.) y sus fragmentos, en función de su tamaño y carga. Se utiliza en química clínica para separar proteínas por carga o tamaño (agarosa IEF, esencialmente independiente del tamaño) y en bioquímica y biología molecular para separar una población mixta de fragmentos de ADN y ARN por longitud, para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN y ARN o para separar proteínas por carga.

Las moléculas de ácido nucleico se separan aplicando un campo eléctrico para mover las moléculas cargadas negativamente a través de una matriz de agarosa u otras sustancias. Las moléculas más cortas se mueven más rápido y migran más lejos que las más largas porque las moléculas más cortas migran más fácilmente a través de los poros del gel. Este fenómeno se llama tamizado. Las proteínas se separan por la carga en la agarosa porque los poros del gel son demasiado pequeños para tamizar las proteínas. La electroforesis en gel también se puede utilizar para la separación de nanopartículas.

La electroforesis en gel utiliza un gel como medio anticonvectivo o medio de tamizado durante la electroforesis, el movimiento de una partícula cargada en una corriente eléctrica. Los geles suprimen la convección térmica provocada por la aplicación del campo eléctrico y también pueden actuar como medio de tamizado, ralentizando el paso de las moléculas; los geles también pueden servir simplemente para mantener la separación final de modo que se pueda aplicar una tinción posterior a la electroforesis. La electroforesis en gel de ADN generalmente se realiza con fines analíticos, a menudo después de la amplificación del ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero puede usarse como una técnica preparatoria antes del uso de otros métodos, como espectrometría de masas, RFLP, PCR, clonación, secuenciación de ADN., o transferencia de Southern para una mayor caracterización.

Base física

Resúmenes de electroforesis de gel.

La electroforesis es un proceso que permite clasificar las moléculas según su tamaño. Usando un campo eléctrico, se pueden hacer que las moléculas (como el ADN) se muevan a través de un gel hecho de agarosa o poliacrilamida. El campo eléctrico consta de una carga negativa en un extremo que empuja las moléculas a través del gel y una carga positiva en el otro extremo que empuja las moléculas a través del gel. Las moléculas que se clasifican se dispensan en un pozo en el material de gel. El gel se coloca en una cámara de electroforesis, que luego se conecta a una fuente de energía. Cuando se aplica el campo eléctrico, las moléculas más grandes se mueven más lentamente a través del gel mientras que las moléculas más pequeñas se mueven más rápido. Las moléculas de diferentes tamaños forman bandas distintas en el gel.

El término "gel" en este caso se refiere a la matriz utilizada para contener, luego separar las moléculas objetivo. En la mayoría de los casos, el gel es un polímero reticulado cuya composición y porosidad se eligen en función del peso específico y la composición del objetivo a analizar. Cuando se separan proteínas o ácidos nucleicos pequeños (ADN, ARN u oligonucleótidos), el gel suele estar compuesto por diferentes concentraciones de acrilamida y un reticulante, lo que produce redes de malla de poliacrilamida de diferentes tamaños. Cuando se separan ácidos nucleicos más grandes (más de unos pocos cientos de bases), la matriz preferida es la agarosa purificada. En ambos casos, el gel forma una matriz sólida pero porosa. La acrilamida, a diferencia de la poliacrilamida, es una neurotoxina y debe manipularse con las precauciones de seguridad adecuadas para evitar el envenenamiento. La agarosa está compuesta por cadenas largas no ramificadas de carbohidratos sin carga y sin enlaces cruzados que dan como resultado un gel con poros grandes que permiten la separación de macromoléculas y complejos macromoleculares.

La electroforesis se refiere a la fuerza electromotriz (EMF) que se utiliza para mover las moléculas a través de la matriz de gel. Al colocar las moléculas en pozos en el gel y aplicar un campo eléctrico, las moléculas se moverán a través de la matriz a diferentes velocidades, determinadas en gran medida por su masa cuando la relación carga-masa (Z) de todas las especies es uniforme. Sin embargo, cuando las cargas no son todas uniformes, el campo eléctrico generado por el procedimiento de electroforesis hará que las moléculas migren de forma diferencial según la carga. Las especies que tienen carga neta positiva migrarán hacia el cátodo que tiene carga negativa (porque se trata de una celda electrolítica en lugar de galvánica), mientras que las especies que tienen carga neta negativa migrarán hacia el ánodo con carga positiva. La masa sigue siendo un factor en la velocidad con la que estas moléculas cargadas de manera no uniforme migran a través de la matriz hacia sus respectivos electrodos.

Si se han cargado varias muestras en pocillos adyacentes en el gel, se ejecutarán en paralelo en carriles individuales. Dependiendo del número de moléculas diferentes, cada carril muestra la separación de los componentes de la mezcla original como una o más bandas distintas, una banda por componente. La separación incompleta de los componentes puede generar bandas superpuestas o manchas indistinguibles que representan múltiples componentes no resueltos. Las bandas en diferentes carriles que terminan a la misma distancia de la parte superior contienen moléculas que atravesaron el gel a la misma velocidad, lo que generalmente significa que tienen aproximadamente el mismo tamaño. Hay marcadores de tamaño de peso molecular disponibles que contienen una mezcla de moléculas de tamaños conocidos. Si dicho marcador se ejecutó en un carril en el gel paralelo a las muestras desconocidas, las bandas observadas se pueden comparar con las de las desconocidas para determinar su tamaño. La distancia que recorre una banda es aproximadamente inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula (alternativamente, esto se puede establecer como que la distancia recorrida es inversamente proporcional al logaritmo del peso molecular de las muestras).

Existen límites para las técnicas electroforéticas. Dado que pasar una corriente a través de un gel provoca calentamiento, los geles pueden derretirse durante la electroforesis. La electroforesis se realiza en soluciones tampón para reducir los cambios de pH debido al campo eléctrico, lo cual es importante porque la carga del ADN y el ARN depende del pH, pero un funcionamiento prolongado puede agotar la capacidad tampón de la solución. También existen limitaciones en la determinación del peso molecular por SDS-PAGE, especialmente cuando se trata de encontrar el PM de una proteína desconocida. Ciertas variables biológicas son difíciles o imposibles de minimizar y pueden afectar la migración electroforética. Dichos factores incluyen la estructura de la proteína, las modificaciones postraduccionales y la composición de aminoácidos. Por ejemplo, la tropomiosina es una proteína ácida que migra de manera anormal en los geles SDS-PAGE. Esto se debe a que los residuos ácidos son repelidos por el SDS cargado negativamente, lo que lleva a una migración y una relación masa-carga inexactas. Además, diferentes preparaciones de material genético pueden no migrar consistentemente entre sí, por motivos morfológicos o de otro tipo.

Tipos de gel

Los tipos de gel más utilizados son los de agarosa y los de poliacrilamida. Cada tipo de gel se adapta bien a diferentes tipos y tamaños del analito. Los geles de poliacrilamida se utilizan generalmente para proteínas y tienen un poder de resolución muy alto para pequeños fragmentos de ADN (5-500 pb). Los geles de agarosa, por otro lado, tienen un poder de resolución más bajo para el ADN pero tienen un mayor rango de separación y, por lo tanto, se usan para fragmentos de ADN de un tamaño generalmente de 50 a 20,000 pb, pero la resolución de más de 6 Mb es posible con campo pulsado electroforesis en gel (PFGE). Los geles de poliacrilamida se ejecutan en una configuración vertical, mientras que los geles de agarosa normalmente se ejecutan horizontalmente en modo submarino. También difieren en su metodología de fundición, ya que la agarosa se solidifica térmicamente, mientras que la poliacrilamida se forma en una reacción de polimerización química.

Agarosa

Insertar el peine de gel en una cámara de electroforesis de gel agarose

Los geles de agarosa están hechos de polímeros de polisacáridos naturales extraídos de algas marinas. Los geles de agarosa se moldean y manipulan fácilmente en comparación con otras matrices porque el fraguado del gel es un cambio físico más que químico. Las muestras también se recuperan fácilmente. Una vez finalizado el experimento, el gel resultante se puede almacenar en una bolsa de plástico en un refrigerador.

Los geles de agarosa no tienen un tamaño de poro uniforme, pero son óptimos para la electroforesis de proteínas de más de 200 kDa. La electroforesis en gel de agarosa también se puede utilizar para la separación de fragmentos de ADN que van desde 50 pares de bases hasta varias megabases (millones de bases), las más grandes de las cuales requieren un aparato especializado. La distancia entre las bandas de ADN de diferentes longitudes está influenciada por el porcentaje de agarosa en el gel, y los porcentajes más altos requieren tiempos de ejecución más prolongados, a veces días. En su lugar, los geles de agarosa de alto porcentaje deben ejecutarse con una electroforesis de campo pulsado (PFE) o electroforesis de inversión de campo.

"La mayoría de los geles de agarosa se fabrican con entre un 0,7 % (buena separación o resolución de fragmentos grandes de ADN de 5 a 10 kb) y un 2 % (buena resolución para fragmentos pequeños de 0,2 a 1 kb) de agarosa disuelta en tampón de electroforesis. Se puede usar hasta un 3% para separar fragmentos muy pequeños, pero en este caso es más apropiado un gel de poliacrilamida vertical. Los geles de bajo porcentaje son muy débiles y pueden romperse cuando intenta levantarlos. Los geles de alto porcentaje a menudo son quebradizos y no se fijan uniformemente. Los geles al 1% son comunes para muchas aplicaciones."

Poliacrilamida

La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) se usa para separar proteínas que varían en tamaño de 5 a 2000 kDa debido al tamaño de poro uniforme proporcionado por el gel de poliacrilamida. El tamaño de los poros se controla mediante la modulación de las concentraciones de polvo de acrilamida y bis-acrilamida que se utilizan para crear un gel. Se debe tener cuidado al crear este tipo de gel, ya que la acrilamida es una neurotoxina potente en sus formas líquida y en polvo.

Las técnicas tradicionales de secuenciación de ADN, como los métodos de Maxam-Gilbert o Sanger, usaban geles de poliacrilamida para separar fragmentos de ADN que diferían en un solo par de bases de longitud para poder leer la secuencia. La mayoría de los métodos modernos de separación de ADN ahora usan geles de agarosa, excepto para fragmentos de ADN particularmente pequeños. Actualmente se usa con mayor frecuencia en el campo de la inmunología y el análisis de proteínas, a menudo para separar diferentes proteínas o isoformas de la misma proteína en bandas separadas. Estos se pueden transferir a una membrana de nitrocelulosa o PVDF para probarlos con anticuerpos y los marcadores correspondientes, como en un western blot.

Por lo general, los geles de resolución se fabrican al 6 %, 8 %, 10 %, 12 % o 15 %. Se vierte gel de apilamiento (5 %) sobre el gel de resolución y se inserta un peine de gel (que forma los pozos y define los carriles donde se colocarán las proteínas, el tampón de muestra y las escaleras). El porcentaje elegido depende del tamaño de la proteína que se desea identificar o sondear en la muestra. Cuanto menor sea el peso conocido, mayor será el porcentaje que se debe utilizar. Los cambios en el sistema tampón del gel pueden ayudar a resolver aún más las proteínas de tamaños muy pequeños.

Almidón

La fécula de patata parcialmente hidrolizada constituye otro medio no tóxico para la electroforesis de proteínas. Los geles son ligeramente más opacos que la acrilamida o la agarosa. Las proteínas no desnaturalizadas se pueden separar según la carga y el tamaño. Se visualizan mediante tinción con negro naftal o negro amido. Las concentraciones típicas de gel de almidón son del 5% al 10%.

Condiciones de gel

Desnaturalización

Perfiles TTGE que representan la diversidad bifidobacteriana de las muestras fecales de dos voluntarios sanos (A y B) antes y después del tratamiento AMC (Acido eslavulónico orgánico)

Los geles desnaturalizantes se ejecutan en condiciones que alteran la estructura natural del analito, lo que hace que se desarrolle en una cadena lineal. Por tanto, la movilidad de cada macromolécula depende únicamente de su longitud lineal y de su relación masa-carga. Por lo tanto, los niveles secundario, terciario y cuaternario de la estructura biomolecular se interrumpen, dejando solo la estructura primaria para analizar.

Los ácidos nucleicos a menudo se desnaturalizan al incluir urea en el tampón, mientras que las proteínas se desnaturalizan con dodecilsulfato de sodio, generalmente como parte del proceso SDS-PAGE. Para la desnaturalización completa de las proteínas, también es necesario reducir los enlaces disulfuro covalentes que estabilizan su estructura terciaria y cuaternaria, un método llamado reducción de PAGE. Las condiciones reductoras generalmente se mantienen mediante la adición de beta-mercaptoetanol o ditiotreitol. Para un análisis general de muestras de proteínas, la reducción de PAGE es la forma más común de electroforesis de proteínas.

Las condiciones de desnaturalización son necesarias para la estimación adecuada del peso molecular del ARN. El ARN es capaz de formar más interacciones intramoleculares que el ADN, lo que puede provocar cambios en su movilidad electroforética. La urea, el DMSO y el glioxal son los agentes desnaturalizantes más utilizados para alterar la estructura del ARN. Originalmente, el hidróxido de metilmercurio altamente tóxico se usaba a menudo en la electroforesis de ARN desnaturalizante, pero puede ser el método de elección para algunas muestras.

La electroforesis en gel desnaturalizante se utiliza en los métodos basados en patrones de bandas de ADN y ARN, electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE) y electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE).

Nativa

Tinificación específica enzimática: Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase isoenzymes in Plasmodium falciparum Infectos glóbulos rojos

Los geles nativos se ejecutan en condiciones no desnaturalizantes para que se mantenga la estructura natural del analito. Esto permite que el tamaño físico del complejo plegado o ensamblado afecte la movilidad, lo que permite el análisis de los cuatro niveles de la estructura biomolecular. Para muestras biológicas, los detergentes se usan solo en la medida en que son necesarios para lisar las membranas lipídicas de la célula. Los complejos permanecen, en su mayor parte, asociados y plegados como lo estarían en la célula. Sin embargo, una desventaja es que es posible que los complejos no se separen de manera limpia o predecible, ya que es difícil predecir cómo la forma y el tamaño de la molécula afectarán su movilidad. Abordar y resolver este problema es un objetivo principal de PAGE nativo cuantitativo.

A diferencia de los métodos de desnaturalización, la electroforesis en gel nativo no utiliza un agente desnaturalizante cargado. Las moléculas que se separan (generalmente proteínas o ácidos nucleicos), por lo tanto, difieren no solo en la masa molecular y la carga intrínseca, sino también en el área de la sección transversal y, por lo tanto, experimentan diferentes fuerzas electroforéticas que dependen de la forma de la estructura general. En el caso de las proteínas, dado que permanecen en su estado nativo, pueden visualizarse no solo mediante reactivos generales de tinción de proteínas, sino también mediante tinción ligada a enzimas específicas.

Un ejemplo de experimento específico de una aplicación de electroforesis en gel nativo es verificar la actividad enzimática para verificar la presencia de la enzima en la muestra durante la purificación de proteínas. Por ejemplo, para la proteína fosfatasa alcalina, la solución de tinción es una mezcla de sal de 4-cloro-2-2metilbencenodiazonio con ácido 3-fosfo-2-naftoico-2'-4'-dimetilanilina en tampón Tris. Esta tinción se vende comercialmente como un kit para geles de tinción. Si la proteína está presente, el mecanismo de la reacción tiene lugar en el siguiente orden: comienza con la desfosforilación del ácido 3-fosfo-2-naftoico-2'-4'-dimetilanilina por la fosfatasa alcalina (Se necesita agua para la reacción). El grupo fosfato se libera y se reemplaza por un grupo alcohol del agua. El electrófilo 4-cloro-2-2 metilbencenodiazonio (sal de diazonio Fast Red TR) desplaza al grupo alcohólico formando el producto final colorante Red Azo. Como su nombre lo indica, este es el producto rojo visible final de la reacción. En la experimentación académica de pregrado de purificación de proteínas, el gel generalmente se ejecuta junto a muestras purificadas comerciales para visualizar los resultados y concluir si la purificación fue exitosa o no.

La electroforesis en gel nativo se usa normalmente en proteómica y metalómica. Sin embargo, la PAGE nativa también se usa para escanear genes (ADN) en busca de mutaciones desconocidas como en el polimorfismo de conformación de cadena única.

Búfers

Los tampones en la electroforesis en gel se utilizan para proporcionar iones que transportan una corriente y para mantener el pH en un valor relativamente constante. Estos amortiguadores contienen muchos iones, lo cual es necesario para el paso de la electricidad a través de ellos. Algo como el agua destilada o el benceno contiene pocos iones, lo que no es ideal para su uso en electroforesis. Hay una serie de tampones utilizados para la electroforesis. El más común es para los ácidos nucleicos Tris/Acetato/EDTA (TAE), Tris/Borato/EDTA (TBE). Se han propuesto muchos otros tampones, p. borato de litio, que rara vez se usa, basado en citas de Pubmed (LB), histidina isoeléctrica, tampones de productos emparejados pK, etc.; en la mayoría de los casos, la supuesta justificación es movilidades de iones adaptadas a una corriente más baja (menos calor), lo que conduce a una vida útil más prolongada. El borato es problemático; El borato puede polimerizar o interactuar con cis dioles como los que se encuentran en el ARN. TAE tiene la capacidad de amortiguamiento más baja pero proporciona la mejor resolución para ADN más grande. Esto significa un voltaje más bajo y más tiempo, pero un mejor producto. LB es relativamente nuevo y no es eficaz para resolver fragmentos de más de 5 kpb; Sin embargo, con su baja conductividad, podría usarse un voltaje mucho más alto (hasta 35 V/cm), lo que significa un tiempo de análisis más corto para la electroforesis de rutina. Se pudo resolver una diferencia de tamaño de un par de bases tan pequeña como en gel de agarosa al 3 % con un medio de conductividad extremadamente baja (borato de litio 1 mM).

La mayoría de las separaciones de proteínas SDS-PAGE se realizan mediante un sistema "discontinuo" (o DISC) sistema tampón que mejora significativamente la nitidez de las bandas dentro del gel. Durante la electroforesis en un sistema de gel discontinuo, se forma un gradiente de iones en la etapa inicial de la electroforesis que hace que todas las proteínas se concentren en una sola banda nítida en un proceso llamado isotacoforesis. La separación de las proteínas por tamaño se logra en la parte inferior, "resolviendo" región del gel. El gel de resolución normalmente tiene un tamaño de poro mucho más pequeño, lo que conduce a un efecto de tamizado que ahora determina la movilidad electroforética de las proteínas.

Visualización

Una vez completada la electroforesis, las moléculas del gel se pueden teñir para hacerlas visibles. El ADN se puede visualizar usando bromuro de etidio que, cuando se intercala en el ADN, emite fluorescencia bajo luz ultravioleta, mientras que la proteína se puede visualizar usando tinción de plata o colorante azul brillante de Coomassie. También se pueden utilizar otros métodos para visualizar la separación de los componentes de la mezcla en el gel. Si las moléculas a separar contienen radiactividad, por ejemplo en un gel de secuenciación de ADN, se puede registrar un autorradiograma del gel. Se pueden tomar fotografías de geles, a menudo utilizando un sistema Gel Doc.

Procesamiento posterior

Después de la separación, se puede utilizar un método de separación adicional, como el enfoque isoeléctrico o SDS-PAGE. A continuación, el gel se cortará físicamente y los complejos proteicos se extraerán de cada porción por separado. A continuación, se puede analizar cada extracto, por ejemplo mediante la toma de huellas dactilares de la masa de péptidos o la secuenciación de péptidos de novo después de la digestión en gel. Esto puede proporcionar una gran cantidad de información sobre las identidades de las proteínas en un complejo.

Aplicaciones

• Estimación del tamaño de las moléculas de ADN después de la digestión de enzimas de restricción, por ejemplo, en la cartografía de restricción del ADN clonado.
• Análisis de productos PCR, por ejemplo en diagnóstico genético molecular o huella genética
• Separación del ADN genómico restringido antes de la transferencia del sur, o del ARN antes de la transferencia del norte.

La electroforesis en gel se utiliza en medicina forense, biología molecular, genética, microbiología y bioquímica. Los resultados se pueden analizar cuantitativamente visualizando el gel con luz ultravioleta y un dispositivo de formación de imágenes de gel. La imagen se graba con una cámara operada por computadora, y la intensidad de la banda o punto de interés se mide y compara con estándares o marcadores cargados en el mismo gel. La medición y el análisis se realizan en su mayoría con software especializado.

Según el tipo de análisis que se realice, a menudo se implementan otras técnicas junto con los resultados de la electroforesis en gel, lo que proporciona una amplia gama de aplicaciones específicas de campo.

Ácidos nucleicos

Un gel agarose de un producto PCR comparado con una escalera de ADN.

En el caso de los ácidos nucleicos, la dirección de la migración, de los electrodos negativos a los positivos, se debe a la carga negativa natural que lleva su cadena principal de azúcar-fosfato.

Los fragmentos de ADN de doble cadena se comportan de forma natural como bastones largos, por lo que su migración a través del gel depende de su tamaño o, en el caso de los fragmentos cíclicos, de su radio de giro. Sin embargo, el ADN circular, como los plásmidos, puede mostrar múltiples bandas, la velocidad de migración puede depender de si está relajado o superenrollado. El ADN o ARN monocatenario tiende a plegarse en moléculas con formas complejas y migrar a través del gel de manera complicada en función de su estructura terciaria. Por lo tanto, los agentes que rompen los enlaces de hidrógeno, como el hidróxido de sodio o la formamida, se utilizan para desnaturalizar los ácidos nucleicos y hacer que se comporten nuevamente como bastones largos.

La electroforesis en gel de ADN o ARN grandes generalmente se realiza mediante electroforesis en gel de agarosa. Consulte el "Método de terminación de cadena" página para ver un ejemplo de un gel de secuenciación de ADN de poliacrilamida. La caracterización a través de la interacción de ligandos de ácidos nucleicos o fragmentos puede realizarse mediante electroforesis de afinidad por cambio de movilidad.

La electroforesis de muestras de ARN se puede utilizar para comprobar la contaminación del ADN genómico y también la degradación del ARN. El ARN de organismos eucarióticos muestra bandas distintas de ARNr 28s y 18s, siendo la banda 28s aproximadamente el doble de intensa que la banda 18s. El ARN degradado tiene bandas menos definidas, tiene un aspecto manchado y la relación de intensidad es inferior a 2:1.

Proteínas

SDS-PAGEpiradiography – Las proteínas indicadas están presentes en diferentes concentraciones en las dos muestras.

Las proteínas, a diferencia de los ácidos nucleicos, pueden tener cargas variables y formas complejas, por lo que es posible que no migren al gel de poliacrilamida a velocidades similares, o todo cuando se coloca un EMF de negativo a positivo en la muestra. Por lo tanto, las proteínas generalmente se desnaturalizan en presencia de un detergente como el dodecilsulfato de sodio (SDS) que recubre las proteínas con una carga negativa. En general, la cantidad de SDS unida es relativa al tamaño de la proteína (generalmente 1,4 g de SDS por gramo de proteína), de modo que las proteínas desnaturalizadas resultantes tienen una carga negativa general y todas las proteínas tienen una relación carga-masa similar. relación. Dado que las proteínas desnaturalizadas actúan como varillas largas en lugar de tener una forma terciaria compleja, la velocidad a la que las proteínas recubiertas de SDS resultantes migran en el gel es relativa solo a su tamaño y no a su carga o forma.

Las proteínas generalmente se analizan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), electroforesis en gel nativo, electroforesis en gel preparativa (QPNC-PAGE) o electroforesis 2-D.

La caracterización a través de la interacción del ligando se puede realizar mediante electrotransferencia o electroforesis de afinidad en agarosa o mediante electroforesis capilar para la estimación de las constantes de unión y la determinación de características estructurales como el contenido de glicanos a través de la unión de lectina.

Nanopartículas

Una aplicación novedosa de la electroforesis en gel es separar o caracterizar nanopartículas de metal u óxido de metal (p. ej., Au, Ag, ZnO, SiO2) con respecto al tamaño, la forma o la química superficial de las nanopartículas. El objetivo es obtener una muestra más homogénea (por ejemplo, una distribución de tamaño de partícula más estrecha), que luego se puede utilizar en otros productos/procesos (por ejemplo, procesos de autoensamblaje). Para la separación de nanopartículas dentro de un gel, el tamaño de partícula sobre el tamaño de malla es el parámetro clave, por lo que se identificaron dos mecanismos de migración: el mecanismo sin restricciones, donde el tamaño de partícula << tamaño de malla, y el mecanismo restringido, donde el tamaño de partícula es similar al tamaño de malla.

Historia

• 1930s – primeros informes del uso de la sucrosa para la electroforesis de gel
• 1955 – introducción de geles de almidón, separación mediocre (Smithies)
• 1959 – introducción de geles de acrilamida; electroforesis discal (Ornstein y Davis); control preciso de parámetros como el tamaño y la estabilidad del poro; y (Raymond y Weintraub)
• 1966 – primer uso de geles de agar
• 1969 – introducción de agentes de desnaturalizadores especialmente separación SDS de subunidad de proteínas (Weber y Osborn)
• 1970 – Laemmli separó 28 componentes de la phage T4 usando un gel de apilación y SDS
• 1972 – geles de agaroa con mancha de bromuro de ethidio
• 1975 – geles bidimensionales (O’Farrell); enfoque isoeléctrico luego electroforesis de gel SDS
• 1977 – geles de secuenciación
• 1983 – electroforesis de gel de campo pulsado permite la separación de grandes moléculas de ADN
• 1983 – introducción de electroforesis capilar
• 2004 – la introducción de un tiempo estandarizado de polimerización de geles de acrilamida permite una separación limpia y predecible de proteínas nativas (Kastenholz)

Un libro de 1959 sobre electroforesis de Milan Bier cita referencias del siglo XIX. Sin embargo, Oliver Smithies hizo contribuciones significativas. Bier afirma: "El método de Smithies... está encontrando una amplia aplicación debido a su poder separador único." Tomado en contexto, Bier implica claramente que Smithies' método es una mejora.