Electroforesis en gel de proteínas.

Electroforesis de proteínas es un método para analizar las proteínas en un fluido o extracto. La electroforesis se puede realizar con un pequeño volumen de muestra de varias formas alternativas con o sin un medio de soporte, concretamente agarosa o poliacrilamida. Las variantes de electroforesis en gel incluyen SDS-PAGE, electroforesis de flujo libre, electroenfoque, isotacoforesis, electroforesis de afinidad, inmunoelectroforesis, contraelectroforesis y electroforesis capilar. Cada variante tiene muchos subtipos con ventajas y limitaciones individuales. La electroforesis en gel a menudo se realiza en combinación con electrotransferencia o inmunotransferencia para brindar información adicional sobre una proteína específica.

Métodos en gel desnaturalizante

PÁGINA SDS

SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, describe una colección de técnicas relacionadas para separar proteínas según su movilidad electroforética (una función del peso molecular de una cadena polipeptídica) mientras se encuentran en el estado desnaturalizado (desplegado). En la mayoría de las proteínas, la unión de SDS a la cadena polipeptídica imparte una distribución uniforme de carga por unidad de masa, lo que resulta en un fraccionamiento por tamaño aproximado durante la electroforesis.

SDS es un agente detergente fuerte que se utiliza para desnaturalizar proteínas nativas en polipéptidos individuales desplegados. Cuando una mezcla de proteínas se calienta a 100 °C en presencia de SDS, el detergente envuelve la columna vertebral del polipéptido. En este proceso, las cargas intrínsecas de los polipéptidos se vuelven insignificantes en comparación con las cargas negativas aportadas por el SDS. Así, los polipéptidos después del tratamiento se convierten en estructuras en forma de varilla que poseen una densidad de carga uniforme, es decir, la misma carga negativa neta por unidad de longitud. Las movilidades electroforéticas de estas proteínas serán una función lineal de los logaritmos de sus pesos moleculares.

Métodos de gel nativo

Los geles nativos, también conocidos como geles no desnaturalizantes, analizan proteínas que aún se encuentran en su estado plegado. Por tanto, la movilidad electroforética depende no sólo de la relación carga-masa, sino también de la forma física y el tamaño de la proteína.

PÁGINA nativa azul

BN-PAGE es una técnica PAGE nativa, donde el tinte azul brillante de Coomassie proporciona las cargas necesarias a los complejos proteicos para la separación electroforética. La desventaja de Coomassie es que al unirse a las proteínas puede actuar como un detergente provocando que los complejos se disocian. Otro inconveniente es la posible extinción de la quimioluminiscencia (por ejemplo, en ensayos de actividad o detección de transferencia Western posteriores) o la fluorescencia de proteínas con grupos protésicos (por ejemplo, hemo o clorofila) o marcadas con tintes fluorescentes.

Borrar PÁGINA nativa

CN-PAGE (comúnmente conocida como PAGE nativa) separa proteínas ácidas solubles en agua y de membrana en un gel en gradiente de poliacrilamida. No utiliza colorante cargado, por lo que la movilidad electroforética de las proteínas en CN-PAGE (a diferencia de la técnica de cambio de carga BN-PAGE) está relacionada con la carga intrínseca de las proteínas. La distancia de migración depende de la carga proteica, su tamaño y el tamaño de los poros del gel. En muchos casos, este método tiene una resolución más baja que BN-PAGE, pero CN-PAGE ofrece ventajas siempre que el tinte Coomassie interfiera con técnicas analíticas adicionales; por ejemplo, se ha descrito como una técnica de separación a microescala muy eficiente para análisis FRET. Además, CN-PAGE es más suave que BN-PAGE, por lo que puede retener conjuntos supramoleculares lábiles de complejos de proteínas de membrana que se disocian en las condiciones de BN-PAGE.

PÁGINA nativa preparatoria

Los complejos de proteínas plegadas de interés se separan de forma limpia y predecible sin riesgo de desnaturalización debido a las propiedades específicas del gel de poliacrilamida, la solución tampón de electroforesis, el equipo electroforético y los parámetros utilizados. Las proteínas separadas se eluyen continuamente en un eluyente fisiológico y se transportan a un recolector de fracciones. En cuatro o cinco fracciones de PAGE cada uno de los cofactores metálicos se pueden identificar y cuantificar absolutamente mediante ICP-MS de alta resolución. Las estructuras asociadas de las metaloproteínas aisladas en estas fracciones se pueden determinar mediante espectroscopia de RMN en solución.

Sistemas de amortiguación

La mayoría de las separaciones de proteínas se realizan utilizando un sistema "discontinuo" (o DISC) sistema tampón que mejora significativamente la nitidez de las bandas dentro del gel. Durante la electroforesis en un sistema de gel discontinuo, se forma un gradiente de iones en la etapa inicial de la electroforesis que hace que todas las proteínas se concentren en una única banda nítida. La formación del gradiente iónico se consigue eligiendo un valor de pH en el que los iones del tampón sólo estén moderadamente cargados en comparación con las proteínas recubiertas con SDS. Estas condiciones proporcionan un entorno en el que las reacciones de Kohlrausch determinan la conductividad molar. Como resultado, las proteínas recubiertas de SDS se concentran varias veces en una zona delgada del orden de 19 μm en unos pocos minutos. En esta etapa, todas las proteínas migran a la misma velocidad de migración mediante isotacoforesis. Esto ocurre en una región del gel que tiene poros más grandes para que la matriz del gel no retrase la migración durante el enfoque o "apilamiento" evento. La separación de las proteínas por tamaño se logra en la parte inferior, "resolutiva" región del gel. El gel de resolución suele tener un tamaño de poro mucho más pequeño, lo que conduce a un efecto de tamizado que ahora determina la movilidad electroforética de las proteínas. Al mismo tiempo, la parte que se separa del gel también tiene un valor de pH en el que los iones tampón llevan en promedio una mayor carga, lo que los hace "superar" las proteínas cubiertas por SDS y eliminan el gradiente iónico y, por tanto, el efecto de apilamiento.

Un sistema tampón discontinuo muy extendido es el sistema tampón trisglicina o "Laemmli" sistema que se acumula a un pH de 6,8 y se resuelve a un pH de ~8,3-9,0. Una desventaja de este sistema es que estos valores de pH pueden promover la formación de enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína en las proteínas porque el pKa de la cisteína varía de 8 a 9 y porque el agente reductor presente en el tampón de carga no co-migra con el proteínas. Los avances recientes en la tecnología de amortiguación alivian este problema al resolver las proteínas a un pH muy por debajo del pKa de la cisteína (p. ej., bis-tris, pH 6,5) e incluyen agentes reductores (p. ej., bisulfito de sodio) que se mueven hacia el gel antes que las proteínas para mantener un ambiente reductor. Un beneficio adicional de utilizar tampones con valores de pH más bajos es que el gel de acrilamida es más estable a valores de pH más bajos, por lo que los geles se pueden almacenar durante largos períodos de tiempo antes de su uso.

Electroforesis de proteínas en gel con gradiente SDS

A medida que se aplica voltaje, los aniones (y las moléculas de muestra cargadas negativamente) migran hacia el electrodo positivo (ánodo) en la cámara inferior, el ion principal es Cl^- (alta movilidad y alta concentración).; El glicinato es el ion final (baja movilidad y baja concentración). Las partículas de proteína SDS no migran libremente en el límite entre el Cl^- del tampón de gel y el Gly^- del tampón catódico. Friedrich Kohlrausch descubrió que la ley de Ohm también se aplica a los electrolitos disueltos. Debido a la caída de voltaje entre los tampones Cl⁻ y glicina, las proteínas se comprimen (apilan) en capas finas micrométricas. El límite se mueve a través de un gradiente de poros y la pila de proteínas se dispersa gradualmente debido a un aumento de la resistencia a la fricción de la matriz del gel. El apilamiento y desapilamiento se produce continuamente en el gel de gradiente, para cada proteína en una posición diferente. Para un desapilamiento completo de proteínas, la concentración del gel de poliacrilamida debe exceder el 16% T. El sistema de dos geles de "Laemmli" Es un gel degradado simple. La discontinuidad del pH de los tampones no tiene importancia para la calidad de la separación, y un "gel de apilamiento" con un pH diferente no es necesario.

Visualización

El tinte de proteínas más popular es el azul brillante de Coomassie. Es un colorante aniónico que se une de forma no específica a las proteínas. Las proteínas del gel se fijan con ácido acético y se tiñen simultáneamente. El exceso de tinte incorporado al gel se puede eliminar decolorando con la misma solución sin tinte. Las proteínas se detectan como bandas azules sobre un fondo claro.

Cuando se necesita un método más sensible que la tinción de Coomassie, generalmente se utiliza la tinción con plata. La tinción con plata es un procedimiento sensible para detectar trazas de proteínas en geles, pero también puede visualizar ácidos nucleicos o polisacáridos.

En el mercado se encuentran disponibles métodos de visualización sin utilizar tintes como Coomassie y plata. Por ejemplo, Bio-Rad Laboratories comercializa geles "sin manchas" para electroforesis en gel SDS-PAGE. Alternativamente, se pueden utilizar tintes fluorescentes reversibles de Azure Biosystems como AzureRed o Azure TotalStain Q.

Al igual que en la electroforesis en gel de ácido nucleico, a menudo se utiliza tinte de seguimiento. En el tampón de muestra normalmente se incluyen colorantes aniónicos de movilidad electroforética conocida. Un tinte de seguimiento muy común es el azul de bromofenol. Este tinte tiene color a pH alcalino y neutro y es una pequeña molécula cargada negativamente que se mueve hacia el ánodo. Al ser una molécula muy móvil, se adelanta a la mayoría de las proteínas.

Aplicaciones médicas

En medicina, la electroforesis de proteínas es un método para analizar las proteínas principalmente en el suero sanguíneo. Antes del uso generalizado de la electroforesis en gel, la electroforesis de proteínas se realizaba como electroforesis de flujo libre (sobre papel) o como inmunoelectroforesis.

Tradicionalmente, se consideran dos clases de proteínas sanguíneas: albúmina sérica y globulina. Generalmente tienen la misma proporción, pero la albúmina como molécula es mucho más pequeña y tiene una carga ligera y negativa, lo que provoca una acumulación de albúmina en el gel electroforético. Una pequeña banda antes de la albúmina representa la transtiretina (también llamada prealbúmina). Algunas formas de medicamentos o sustancias químicas del cuerpo pueden causar su propia banda, pero generalmente es pequeña. Se observan bandas anormales (picos) en la gammapatía monoclonal de significado indeterminado y en el mieloma múltiple, y son útiles en el diagnóstico de estas afecciones.

Las globulinas se clasifican por su patrón de bandas (con sus principales representantes):

• El alfa (α) banda consta de dos partes, 1 y 2:
  • α₁ - α1-antitripsina, α₁- glicoproteína ácido.
  • α₂ - haptoglobina, α2-macroglobulina, α2-antiplasmina, ceruloplasma.
• El beta (β) banda - transferrina, LDL, complemento
• El gamma (γ) banda - inmunoglobulina (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM). Las paraproteínas (en el mieloma múltiple) generalmente aparecen en esta banda.

El procedimiento médico presente normal implica la determinación de numerosas proteínas en plasma incluyendo hormonas y enzimas, algunas de ellas también determinadas por la electroforesis. Sin embargo, la electroforesis de gel es principalmente una herramienta de investigación, también cuando el sujeto es proteínas de sangre.