Electrofisiología

Electrofisiología (del griego ἥλεκτ, ēlektron, "ámbar" [consulte la etimología de "electrón"]; φύσις, physis, "naturaleza, origen"; y -λογία, -logia) es la rama de la fisiología que estudia las propiedades eléctricas de las células y tejidos biológicos. Implica mediciones de cambios de voltaje o corriente eléctrica o manipulaciones en una amplia variedad de escalas, desde proteínas de un solo canal iónico hasta órganos completos como el corazón. En neurociencia, incluye mediciones de la actividad eléctrica de las neuronas y, en particular, la actividad del potencial de acción. Las grabaciones de señales eléctricas a gran escala del sistema nervioso, como la electroencefalografía, también pueden denominarse grabaciones electrofisiológicas. Son útiles para electrodiagnóstico y monitorización.

"Clamp Ardiente" es una técnica común en la electrofisiología. Esta es una grabación de clamp corriente de células enteras de un disparo de neurona debido a su depolarización por la inyección actual

Definición y alcance

Técnicas electrofisiológicas clásicas

Principio y mecanismos

La electrofisiología es la rama de la fisiología que se relaciona ampliamente con el flujo de iones (corriente de iones) en los tejidos biológicos y, en particular, con las técnicas de registro eléctrico que permiten la medición de este flujo. Las técnicas clásicas de electrofisiología implican la colocación de electrodos en diversas preparaciones de tejido biológico. Los principales tipos de electrodos son:

1. Conductores sólidos simples, como discos y agujas (singles o arrays, a menudo aislados excepto para la punta),
2. Tracings en tableros de circuito impresos o polímeros flexibles, también aislados excepto para la punta, y
3. Tubos huecos, a menudo alargados o 'pulidos', llenos de un electrolito, como pipetas de vidrio rellenas con solución de cloruro de potasio u otra solución electrolítica.

Los principales preparativos incluyen:

1. organismos vivos (ejemplo en insectos),
2. tejido exciso (agudo o cultivado),
3. células disociadas del tejido exciso (aguda o cultivado),
4. células o tejidos cultivados artificialmente, o
5. híbridos de arriba.

La electrofisiología neuronal es el estudio de las propiedades eléctricas de las células y tejidos biológicos dentro del sistema nervioso. Con la electrofisiología neuronal, los médicos y especialistas pueden determinar cómo ocurren los trastornos neuronales al observar la actividad cerebral del individuo. Actividad como qué partes del cerebro se iluminan durante cualquier situación encontrada. Si un electrodo tiene un diámetro lo suficientemente pequeño (micrómetros), entonces el electrofisiólogo puede optar por insertar la punta en una sola celda. Tal configuración permite la observación directa y el registro intracelular de la actividad eléctrica intracelular de una sola célula. Sin embargo, esta configuración invasiva reduce la vida de la célula y provoca una fuga de sustancias a través de la membrana celular. La actividad intracelular también se puede observar usando una pipeta de vidrio especialmente formada (hueca) que contiene un electrolito. En esta técnica, la punta de la pipeta microscópica se presiona contra la membrana celular, a la que se adhiere fuertemente por una interacción entre el vidrio y los lípidos de la membrana celular. El electrolito dentro de la pipeta se puede llevar a una continuidad fluida con el citoplasma al administrar un pulso de presión negativa a la pipeta para romper el pequeño parche de membrana rodeado por el borde de la pipeta (registro de células completas). Alternativamente, la continuidad iónica se puede establecer "perforando" el parche al permitir que el agente formador de poros exógeno dentro del electrolito se inserte en el parche de la membrana (registro del parche perforado). Finalmente, el parche puede dejarse intacto (grabación de parche).

El electrofisiólogo puede optar por no insertar la punta en una sola celda. En su lugar, la punta del electrodo puede dejarse en continuidad con el espacio extracelular. Si la punta es lo suficientemente pequeña, tal configuración puede permitir la observación indirecta y el registro de los potenciales de acción de una sola célula, lo que se denomina registro de una sola unidad. Según la preparación y la ubicación precisa, una configuración extracelular puede captar la actividad de varias células cercanas simultáneamente, lo que se denomina registro de unidades múltiples.

A medida que aumenta el tamaño del electrodo, disminuye el poder de resolución. Los electrodos más grandes son sensibles solo a la actividad neta de muchas células, denominadas potenciales de campo locales. Los electrodos aún más grandes, como las agujas sin aislamiento y los electrodos de superficie utilizados por neurofisiólogos clínicos y quirúrgicos, son sensibles solo a ciertos tipos de actividad sincrónica dentro de poblaciones de células que se cuentan por millones.

Otras técnicas electrofisiológicas clásicas incluyen el registro de un solo canal y la amperometría.

Modalidades electrográficas por parte del cuerpo

El registro electrofisiológico en general a veces se denomina electrografía (de electro- + -grafía, "registro eléctrico"), siendo el registro así producido un electrograma Sin embargo, la palabra electrografía tiene otros sentidos (incluida la electrofotografía), y los tipos específicos de registro electrofisiológico suelen recibir nombres específicos, construidos según el patrón de electro- + [ forma de combinación de partes del cuerpo] + -grafía (abreviatura ExG). En relación con esto, la palabra electrograma (que no se necesita para esos otros sentidos) a menudo tiene el significado específico de electrograma intracardíaco, que es como un electrocardiograma pero con algunas derivaciones invasivas (dentro del corazón) en lugar de solo derivaciones no invasivas. (en la piel). El registro electrofisiológico con fines de diagnóstico clínico se incluye dentro de la categoría de pruebas de electrodiagnóstico. Los diversos "ExG" modos son los siguientes:

Técnicas electrofisiológicas ópticas

Las técnicas electrofisiológicas ópticas fueron creadas por científicos e ingenieros para superar una de las principales limitaciones de las técnicas clásicas. Las técnicas clásicas permiten la observación de la actividad eléctrica en aproximadamente un único punto dentro de un volumen de tejido. Las técnicas clásicas singularizan un fenómeno distribuido. El interés por la distribución espacial de la actividad bioeléctrica impulsó el desarrollo de moléculas capaces de emitir luz en respuesta a su entorno eléctrico o químico. Algunos ejemplos son los colorantes sensibles al voltaje y las proteínas fluorescentes.

Después de introducir uno o más de dichos compuestos en el tejido mediante perfusión, inyección o expresión génica, se puede observar y registrar la distribución unidimensional o bidimensional de la actividad eléctrica.

Registro intracelular

El registro intracelular consiste en medir el voltaje y/o la corriente a través de la membrana de una célula. Para realizar un registro intracelular, se debe insertar la punta de un microelectrodo fino (afilado) dentro de la célula, de modo que se pueda medir el potencial de membrana. Por lo general, el potencial de membrana en reposo de una célula sana será de -60 a -80 mV, y durante un potencial de acción el potencial de membrana podría llegar a +40 mV. En 1963, Alan Lloyd Hodgkin y Andrew Fielding Huxley ganaron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por su contribución a la comprensión de los mecanismos subyacentes a la generación de potenciales de acción en las neuronas. Sus experimentos incluyeron registros intracelulares del axón gigante del calamar del Atlántico (Loligo pealei), y fueron de las primeras aplicaciones de la "pinza de voltaje" técnica. Hoy en día, la mayoría de los microelectrodos utilizados para el registro intracelular son micropipetas de vidrio, con un diámetro de punta de < 1 micrómetro y una resistencia de varios megaohmios. Las micropipetas se llenan con una solución que tiene una composición iónica similar al líquido intracelular de la célula. Un cable de plata clorurada insertado en la pipeta conecta eléctricamente el electrolito al amplificador y al circuito de procesamiento de señales. El voltaje medido por el electrodo se compara con el voltaje de un electrodo de referencia, generalmente un alambre de plata recubierto de cloruro de plata en contacto con el líquido extracelular alrededor de la celda. En general, cuanto más pequeña es la punta del electrodo, mayor es su resistencia eléctrica, por lo que un electrodo es un compromiso entre el tamaño (lo suficientemente pequeño para penetrar una sola célula con el mínimo daño a la célula) y la resistencia (lo suficientemente bajo como para que las señales neuronales pequeñas puedan ser detectadas). discernido del ruido térmico en la punta del electrodo).

Pinza de tensión

La abrazadera de tensión utiliza un mecanismo de retroalimentación negativo. El amplificador potencial de membrana mide tensión de membrana y envía salida al amplificador de retroalimentación. El amplificador de retroalimentación resta el voltaje de la membrana del voltaje del comando, que recibe del generador de señal. Esta señal es amplificada y devuelta en la célula a través del electrodo de grabación.

La técnica de fijación de voltaje permite a un experimentador "sujetar" el potencial de la celda en un valor elegido. Esto permite medir la cantidad de corriente iónica que cruza la membrana de una célula a cualquier voltaje dado. Esto es importante porque muchos de los canales iónicos en la membrana de una neurona son canales iónicos controlados por voltaje, que se abren solo cuando el voltaje de la membrana está dentro de un cierto rango. Las mediciones de tensión de abrazadera de corriente son posibles gracias a la sustracción digital casi simultánea de corrientes capacitivas transitorias que pasan cuando el electrodo de registro y la membrana de la celda se cargan para alterar el potencial de la celda.

Pinza amperimétrica

La técnica de pinza amperimétrica registra el potencial de membrana inyectando corriente en una celda a través del electrodo de registro. A diferencia del modo de abrazadera de voltaje, donde el potencial de membrana se mantiene en un nivel determinado por el experimentador, en el modo de "pinza de corriente" modo, el potencial de membrana es libre de variar, y el amplificador registra cualquier voltaje que la célula genere por sí misma o como resultado de la estimulación. Esta técnica se utiliza para estudiar cómo responde una célula cuando entra corriente eléctrica en una célula; esto es importante, por ejemplo, para comprender cómo responden las neuronas a los neurotransmisores que actúan abriendo los canales iónicos de la membrana.

La mayoría de los amplificadores de abrazadera de corriente proporcionan poca o ninguna amplificación de los cambios de voltaje registrados desde la celda. El "amplificador" es en realidad un electrómetro, a veces denominado "amplificador de ganancia unitaria"; su propósito principal es reducir la carga eléctrica en las pequeñas señales (en el rango de mV) producidas por las celdas para que puedan ser registradas con precisión por la electrónica de baja impedancia. El amplificador aumenta la corriente detrás de la señal mientras disminuye la resistencia por la que pasa esa corriente. Considere este ejemplo basado en la ley de Ohm: se genera un voltaje de 10 mV al pasar 10 nanoamperios de corriente a través de 1 MΩ de resistencia. El electrómetro cambia esta "señal de alta impedancia" a una "señal de baja impedancia" usando un circuito seguidor de voltaje. Un seguidor de voltaje lee el voltaje en la entrada (causado por una pequeña corriente a través de una gran resistencia). Luego da instrucciones a un circuito paralelo que tiene una gran fuente de corriente detrás (la red eléctrica) y ajusta la resistencia de ese circuito paralelo para dar el mismo voltaje de salida, pero a través de una resistencia más baja.

Grabación de abrazadera de parche

La abrazadera de parche adherida a la célula utiliza un micropipette conectado a la membrana celular para permitir la grabación de un solo canal de iones.

Esta técnica fue desarrollada por Erwin Neher y Bert Sakmann, quienes recibieron el Premio Nobel en 1991. El registro intracelular convencional consiste en atravesar una célula con un electrodo fino; La grabación patch-clamp adopta un enfoque diferente. Un microelectrodo de abrazadera de parche es una micropipeta con un diámetro de punta relativamente grande. El microelectrodo se coloca junto a una célula y se aplica una succión suave a través del microelectrodo para extraer un trozo de la membrana celular (el 'parche') hacia la punta del microelectrodo; la punta de vidrio forma un 'sello' de alta resistencia; con la membrana celular. Esta configuración es la "adjunta a celda" modo, y se puede utilizar para estudiar la actividad de los canales iónicos que están presentes en el parche de la membrana. Si ahora se aplica más succión, el pequeño parche de membrana en la punta del electrodo se puede desplazar, dejando el electrodo sellado al resto de la celda. Esta "célula completa" El modo permite un registro intracelular muy estable. Una desventaja (en comparación con el registro intracelular convencional con electrodos afilados) es que el líquido intracelular de la célula se mezcla con la solución dentro del electrodo de registro, por lo que se pueden diluir algunos componentes importantes del líquido intracelular. Una variante de esta técnica, el "parche perforado" técnica, trata de minimizar estos problemas. En lugar de aplicar succión para desplazar el parche de membrana de la punta del electrodo, también es posible hacer pequeños orificios en el parche con agentes formadores de poros para que las moléculas grandes, como las proteínas, puedan permanecer dentro de la célula y los iones puedan atravesar los orificios libremente.. Además, el parche de membrana se puede separar del resto de la célula. Este enfoque permite analizar farmacológicamente las propiedades de la membrana del parche. Patch-clamp también se puede combinar con la secuenciación de ARN en una técnica conocida como patch-seq mediante la extracción del contenido celular después del registro para caracterizar la relación de las propiedades electrofisiológicas con la expresión génica y el tipo de célula.

Registro de electrodos afilados

En situaciones en las que se desea registrar el potencial dentro de la membrana celular con un efecto mínimo sobre la constitución iónica del fluido intracelular, se puede utilizar un electrodo afilado. Estas micropipetas (electrodos) son de nuevo como las pinzas de parche extraídas de los capilares de vidrio, pero el poro es mucho más pequeño, por lo que hay muy poco intercambio de iones entre el líquido intracelular y el electrolito en la pipeta. La resistencia eléctrica del electrodo de la micropipeta se reduce al llenarlo con KCl 2-4 M, en lugar de una concentración de sal que imita las concentraciones iónicas intracelulares que se usan en la sujeción del parche. A menudo, la punta del electrodo se llena con varios tipos de tintes, como el amarillo Lucifer, para rellenar las células registradas, para luego confirmar su morfología bajo un microscopio. Los tintes se inyectan aplicando un voltaje de CC o pulsado positivo o negativo a los electrodos dependiendo de la polaridad del tinte.

Registro extracelular

Grabación de una sola unidad

Un electrodo introducido en el cerebro de un animal vivo detectará la actividad eléctrica generada por las neuronas adyacentes a la punta del electrodo. Si el electrodo es un microelectrodo, con un tamaño de punta de aproximadamente 1 micrómetro, el electrodo normalmente detectará la actividad de una neurona como máximo. La grabación de esta forma se denomina en general "unidad única" grabación. Los potenciales de acción registrados son muy parecidos a los potenciales de acción que se registran intracelularmente, pero las señales son mucho más pequeñas (típicamente alrededor de 1 mV). La mayoría de los registros de la actividad de neuronas individuales en animales anestesiados y conscientes se realizan de esta manera. Las grabaciones de neuronas individuales en animales vivos han proporcionado información importante sobre cómo el cerebro procesa la información. Por ejemplo, David Hubel y Torsten Wiesel registraron la actividad de neuronas individuales en la corteza visual primaria del gato anestesiado y mostraron cómo las neuronas individuales en esta área responden a características muy específicas de un estímulo visual. Hubel y Wiesel recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1981.

Grabación de varias unidades

Si la punta del electrodo es un poco más grande, entonces el electrodo podría registrar la actividad generada por varias neuronas. Este tipo de grabación a menudo se denomina "grabación de unidades múltiples" y se usa a menudo en animales conscientes para registrar cambios en la actividad en un área discreta del cerebro durante la actividad normal. Los registros de uno o más de estos electrodos que están muy juntos se pueden usar para identificar el número de celdas a su alrededor, así como cuáles de los picos provienen de qué celda. Este proceso se denomina clasificación de picos y es adecuado en áreas donde hay tipos identificados de células con características de picos bien definidas. Si la punta del electrodo es aún más grande, en general no se puede distinguir la actividad de las neuronas individuales, pero el electrodo aún podrá registrar un potencial de campo generado por la actividad de muchas células.

Potenciales de campo

Un diagrama esquemático que muestra una grabación potencial de campo de rata hipocampo. A la izquierda se encuentra un diagrama esquemático de un terminal presínico y neurona posíptica. Esto significa representar a una gran población de sinapsis y neuronas. Cuando la sinapsis libera glutamato en la célula postináptica, abre los canales de receptores ionotropic glutamato. El flujo neto de corriente es interior, por lo que se genera un fregadero actual. Un electrodo cercano (#2) detecta esto como una negatividad. An intracelular electrodo colocado dentro del cuerpo celular (#1) registra el cambio en el potencial de membrana que causa la corriente entrante.

Los potenciales de campo extracelulares son sumideros o fuentes de corriente locales que son generados por la actividad colectiva de muchas células. Por lo general, un potencial de campo se genera por la activación simultánea de muchas neuronas por transmisión sináptica. El diagrama de la derecha muestra los potenciales de campo sináptico del hipocampo. A la derecha, el trazo inferior muestra una onda negativa que corresponde a un sumidero de corriente causado por las cargas positivas que ingresan a las células a través de los receptores de glutamato postsinápticos, mientras que el trazo superior muestra una onda positiva que es generada por la corriente que sale de la célula (en el cuerpo) para completar el circuito. Para obtener más información, consulte potencial de campo local.

Amperometría

La amperometría utiliza un electrodo de carbono para registrar cambios en la composición química de los componentes oxidados de una solución biológica. La oxidación y la reducción se logran cambiando el voltaje en la superficie activa del electrodo de registro en un proceso conocido como "escaneo". Debido a que ciertas sustancias químicas cerebrales pierden o ganan electrones a voltajes característicos, se pueden identificar especies individuales. La amperometría se ha utilizado para estudiar la exocitosis en los sistemas nervioso y endocrino. Muchos neurotransmisores de monoamina; por ejemplo, la norepinefrina (noradrenalina), la dopamina y la serotonina (5-HT) son oxidables. El método también se puede usar con células que no secretan neurotransmisores oxidables al "cargar" ellos con 5-HT o dopamina.

Abrazadera de parche plano

La abrazadera de parche plano es un método novedoso desarrollado para electrofisiología de alto rendimiento. En lugar de colocar una pipeta en una célula adherente, la suspensión celular se pipetea en un chip que contiene una abertura microestructurada. Luego se coloca una sola celda en el orificio por succión y se forma una conexión hermética (Gigaseal). La geometría plana ofrece una variedad de ventajas en comparación con el experimento clásico:

• Permite la integración de microfluidics, lo que permite la aplicación de compuesto automático para la detección de canales ion.
• El sistema es accesible para técnicas de sonda óptica o de escaneo.
• Se puede realizar la perfusión del lado intracelular.

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  Dibujo esquemático de la configuración clásica del parche. La pipeta de parche se traslada a la célula usando un micromanipulador bajo control óptico. Los movimientos relativos entre la pipeta y la célula tienen que ser evitados para mantener intacta la conexión de la pila.

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  Escaneando la imagen del microscopio electrónico de una pipeta de parche.

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  En la configuración de parche plano, la célula está posicionada por succión. Los movimientos relativos entre célula y abertura pueden ser excluidos después del sellado. Una mesa antivibración no es necesaria.

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  Escaneando la imagen del microscopio electrónico de un chip de pinza de parche plano. Tanto la pipeta como el chip están hechos de vidrio borosilicato.

Otros métodos

Basado en membrana de soporte sólido (SSM)

Con este enfoque electrofisiológico, los proteoliposomas, las vesículas de membrana o los fragmentos de membrana que contienen el canal o el transportador de interés se adsorben en una monocapa lipídica pintada sobre un electrodo funcionalizado. Este electrodo consta de un soporte de vidrio, una capa de cromo, una capa de oro y una monocapa de octadecilmercaptano. Debido a que la membrana pintada está sostenida por el electrodo, se denomina membrana de soporte sólido. Es importante señalar que las perturbaciones mecánicas, que normalmente destruyen una membrana lipídica biológica, no influyen en el tiempo de vida de un SSM. El electrodo capacitivo (compuesto por el SSM y las vesículas absorbidas) es tan estable mecánicamente que las soluciones pueden intercambiarse rápidamente en su superficie. Esta propiedad permite la aplicación de saltos rápidos de concentración de sustrato/ligando para investigar la actividad electrogénica de la proteína de interés, medida a través del acoplamiento capacitivo entre las vesículas y el electrodo.

Ensayo de reconocimiento bioeléctrico (BERA)

El ensayo de reconocimiento bioeléctrico (BERA) es un método novedoso para la determinación de diversas moléculas químicas y biológicas mediante la medición de los cambios en el potencial de membrana de las células inmovilizadas en una matriz de gel. Aparte de la mayor estabilidad de la interfaz electrodo-célula, la inmovilización preserva la viabilidad y las funciones fisiológicas de las células. BERA se utiliza principalmente en aplicaciones de biosensores para analizar analitos que pueden interactuar con las células inmovilizadas cambiando el potencial de la membrana celular. De esta manera, cuando se agrega una muestra positiva al sensor, se genera una característica, "similar a una firma" se produce un cambio en el potencial eléctrico. BERA es la tecnología central detrás del proyecto paneuropeo FOODSCAN lanzado recientemente, sobre la evaluación de riesgos de plaguicidas y alimentos en Europa. BERA se ha utilizado para la detección de virus humanos (virus de la hepatitis B y C y virus del herpes), agentes de enfermedades veterinarias (virus de la fiebre aftosa, priones y virus de la lengua azul) y virus de plantas (virus del tabaco y del pepino) en un manera específica, rápida (1-2 minutos), reproducible y rentable. El método también se ha utilizado para la detección de toxinas ambientales, como pesticidas y micotoxinas en alimentos, y 2,4,6-tricloroanisol en corcho y vino, así como para la determinación de concentraciones muy bajas del anión superóxido en muestras clínicas..

Un sensor BERA consta de dos partes:

• Los elementos de biorecognición consumibles
• El dispositivo de lectura electrónica con inteligencia artificial incrustada.

Un avance reciente es el desarrollo de una técnica denominada identificación molecular mediante ingeniería de membranas (MIME). Esta técnica permite construir células con una especificidad definida para prácticamente cualquier molécula de interés, mediante la incorporación de miles de receptores artificiales en la membrana celular.

Electrofisiología computacional

Aunque no se trata estrictamente de una medida experimental, se han desarrollado métodos para examinar las propiedades conductoras de proteínas y biomembranas in silico. Se trata principalmente de simulaciones de dinámica molecular en las que un sistema modelo, como una bicapa lipídica, se somete a un voltaje aplicado externamente. Los estudios que utilizan estas configuraciones han podido estudiar fenómenos dinámicos como la electroporación de membranas y la translocación de iones por canales.

El beneficio de tales métodos es el alto nivel de detalle del mecanismo de conducción activo, dado por la inherentemente alta resolución y densidad de datos que ofrece la simulación atomística. Existen inconvenientes significativos, dados por la incertidumbre de la legitimidad del modelo y el costo computacional de modelar sistemas que son lo suficientemente grandes y en escalas de tiempo suficientes para considerar que reproducen las propiedades macroscópicas de los propios sistemas. Si bien las simulaciones atomísticas pueden acceder a escalas de tiempo cercanas o en el dominio de microsegundos, esto sigue siendo varios órdenes de magnitud más bajo que incluso la resolución de métodos experimentales como la fijación de parches.

Electrofisiología clínica

La electrofisiología clínica es el estudio de cómo se pueden aplicar los principios y tecnologías electrofisiológicos a la salud humana. Por ejemplo, la electrofisiología cardíaca clínica es el estudio de las propiedades eléctricas que gobiernan el ritmo y la actividad del corazón. La electrofisiología cardíaca se puede utilizar para observar y tratar trastornos como la arritmia (latidos cardíacos irregulares). Por ejemplo, un médico puede insertar un catéter que contiene un electrodo en el corazón para registrar la actividad eléctrica del músculo cardíaco.

Otro ejemplo de electrofisiología clínica es la neurofisiología clínica. En esta especialidad médica, los médicos miden las propiedades eléctricas del cerebro, la médula espinal y los nervios. Se considera que científicos como Duchenne de Boulogne (1806–1875) y Nathaniel A. Buchwald (1924–2006) han avanzado mucho en el campo de la neurofisiología, permitiendo sus aplicaciones clínicas.

Directrices de informes clínicos

Los estándares de información mínima (MI) o las pautas de informes especifican la cantidad mínima de metadatos (información) y datos necesarios para cumplir un objetivo o objetivos específicos en un estudio clínico. La "Información Mínima sobre una Investigación en Neurociencia" La familia (MINI) de documentos de directrices para informes tiene como objetivo proporcionar un conjunto coherente de directrices para informar sobre un experimento de electrofisiología. En la práctica, un módulo MINI comprende una lista de verificación de la información que debe proporcionarse (por ejemplo, sobre los protocolos empleados) cuando se describe un conjunto de datos para su publicación.