Edición de genes CRISPR

La edición de genes CRISPR es una técnica de ingeniería genética en biología molecular mediante la cual se pueden modificar los genomas de los organismos vivos. Se basa en una versión simplificada del sistema de defensa antiviral bacteriano CRISPR-Cas9. Al administrar la nucleasa Cas9 complejada con un ARN guía sintético (ARNg) en una célula, el genoma de la célula se puede cortar en la ubicación deseada, lo que permite eliminar los genes existentes y/o agregar otros nuevos in vivo.

La técnica se considera de gran importancia en biotecnología y medicina, ya que permite editar genomas in vivo de forma muy precisa, económica y sencilla. Se puede utilizar en la creación de nuevos medicamentos, productos agrícolas y organismos genéticamente modificados, o como un medio para controlar patógenos y plagas. También tiene posibilidades en el tratamiento de enfermedades genéticas hereditarias así como enfermedades derivadas de mutaciones somáticas como el cáncer. Sin embargo, su uso en la modificación genética de la línea germinal humana es muy controvertido. El desarrollo de la técnica les valió a Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier el Premio Nobel de Química en 2020. El tercer grupo de investigadores que compartió el Premio Kavli por el mismo descubrimiento, liderado por Virginijus Šikšnys, no recibió el Premio Nobel.

Trabajando como tijeras genéticas, la nucleasa Cas9 abre ambas hebras de la secuencia de ADN objetivo para introducir la modificación mediante uno de dos métodos. Las mutaciones automáticas, facilitadas a través de la reparación dirigida por homología (HDR), son la vía tradicional de los enfoques de edición genómica dirigida. Esto permite la introducción de daño y reparación de ADN específicos. HDR emplea el uso de secuencias de ADN similares para impulsar la reparación de la rotura mediante la incorporación de ADN exógeno para que funcione como plantilla de reparación.Este método se basa en la aparición periódica y aislada de daños en el ADN en el sitio objetivo para que comience la reparación. Las mutaciones knock-out causadas por CRISPR-Cas9 dan como resultado la reparación de la ruptura de doble cadena mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ). NHEJ a menudo puede resultar en eliminaciones o inserciones aleatorias en el sitio de reparación, lo que puede interrumpir o alterar la funcionalidad del gen. Por lo tanto, la ingeniería genómica de CRISPR-Cas9 brinda a los investigadores la capacidad de generar una alteración genética aleatoria específica. Debido a esto, la precisión de la edición del genoma es una gran preocupación. La edición genómica conduce a cambios irreversibles en el genoma.

Si bien la edición del genoma en células eucariotas ha sido posible utilizando varios métodos desde la década de 1980, los métodos empleados demostraron ser ineficientes y poco prácticos para implementar a gran escala. Con el descubrimiento de CRISPR y específicamente de la molécula de nucleasa Cas9, la edición eficiente y altamente selectiva es ahora una realidad. Cas9 derivado de la especie bacteriana Streptococcus pyogenes ha facilitado la modificación genómica dirigida en células eucariotas al permitir un método confiable para crear una ruptura dirigida en una ubicación específica designada por las hebras guía crRNA y tracrRNA.La facilidad con la que los investigadores pueden insertar Cas9 y la plantilla de ARN para silenciar o provocar mutaciones puntuales en loci específicos ha demostrado ser invaluable para el mapeo rápido y eficiente de modelos genómicos y procesos biológicos asociados con varios genes en una variedad de eucariotas. Se han desarrollado variantes recientemente diseñadas de la nucleasa Cas9 que reducen significativamente la actividad fuera del objetivo.

Las técnicas de edición del genoma CRISPR-Cas9 tienen muchas aplicaciones potenciales, incluso en medicina y agricultura. El uso del complejo CRISPR-Cas9-gRNA para la edición del genoma fue la elección de la AAAS para el avance del año en 2015. Se han planteado muchas inquietudes bioéticas sobre la posibilidad de utilizar CRISPR para la edición de la línea germinal, especialmente en embriones humanos.

Historia

Otros metodos

A principios de la década de 2000, investigadores alemanes comenzaron a desarrollar nucleasas con dedos de zinc (ZFN), proteínas sintéticas cuyos dominios de unión al ADN les permiten crear rupturas de doble cadena en el ADN en puntos específicos. ZFN tiene una mayor precisión y la ventaja de ser más pequeño que Cas9, pero ZFN no se usa con tanta frecuencia como los métodos basados ​​en CRISPR. En 2010, las nucleasas sintéticas denominadas nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN, por sus siglas en inglés) proporcionaron una forma más fácil de dirigir una ruptura de doble cadena a una ubicación específica en la cadena de ADN. Tanto las nucleasas con dedos de zinc como las TALEN requieren el diseño y la creación de una proteína personalizada para cada secuencia de ADN objetivo, que es un proceso mucho más difícil y lento que el diseño de ARN guía. Los CRISPR son mucho más fáciles de diseñar porque el proceso requiere sintetizar solo una secuencia corta de ARN,

Mientras que los métodos como el ARN de interferencia (ARNi) no suprimen por completo la función de los genes, CRISPR, ZFN y TALEN proporcionan una desactivación genética irreversible total. CRISPR también puede apuntar a varios sitios de ADN simultáneamente simplemente introduciendo diferentes ARNg. Además, los costos de emplear CRISPR son relativamente bajos.

Descubrimiento

En 2012, Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier publicaron su hallazgo de que CRISPR-Cas9 podría programarse con ARN para editar ADN genómico, ahora considerado uno de los descubrimientos más importantes en la historia de la biología.

Patentes y comercialización

En noviembre de 2013, SAGE Labs (parte del grupo Horizon Discovery) tenía los derechos exclusivos de una de esas empresas para producir y vender ratas modificadas genéticamente y derechos no exclusivos para modelos de ratones y conejos. En 2015, Thermo Fisher Scientific obtuvo la licencia de propiedad intelectual de ToolGen para desarrollar kits de reactivos CRISPR.

A partir de diciembre de 2014, se impugnaron los derechos de patente de CRISPR. Se formaron varias compañías para desarrollar medicamentos relacionados y herramientas de investigación. A medida que las empresas aumentaron la financiación, surgieron dudas sobre si CRISPR podría monetizarse rápidamente. En 2014, Feng Zhang del Instituto Broad del MIT y Harvard y otros nueve obtuvieron la patente número 8697359 sobre el uso de la edición de genes CRISPR-Cas9 en eucariotas. Aunque Charpentier y Doudna (conocidos como CVC) fueron acreditados por la concepción de CRISPR, el Instituto Broad fue el primero en lograr una "reducción a la práctica" según los jueces de patentes Sally Gardner Lane, James T. Moore y Deborah Katz.

El primer conjunto de patentes se otorgó al equipo de Broad en 2015, lo que llevó a los abogados del grupo CVC a solicitar el primer procedimiento de interferencia. En febrero de 2017, la Oficina de Patentes de EE. UU. se pronunció sobre un caso de interferencia de patentes presentado por la Universidad de California con respecto a las patentes otorgadas al Instituto Broad, y encontró que las patentes de Broad, con reclamos que cubrían la aplicación de CRISPR-Cas9 en células eucariotas, eran distintas. de las invenciones reclamadas por la Universidad de California.

Poco después, la Universidad de California presentó una apelación de este fallo. En 2019 se abrió la segunda disputa por injerencia. Esto fue en respuesta a las solicitudes de patente realizadas por CVC que requerían que la junta de apelaciones determinara el inventor original de la tecnología. La USPTO falló en marzo de 2022 en contra de la UC, afirmando que el Instituto Broad fue el primero en presentar la solicitud. La decisión afectó a muchos de los acuerdos de licencia de la tecnología de edición CRISPR que obtuvo la licencia de UC Berkeley. La UC manifestó su intención de apelar la decisión de la USPTO.

Eventos recientes

En marzo de 2017, la Oficina Europea de Patentes (EPO) anunció su intención de permitir reclamaciones para la edición de todo tipo de celdas al Instituto Max-Planck de Berlín, la Universidad de California y la Universidad de Viena, y en agosto de 2017, la EPO anunció su intención para permitir reclamos de CRISPR en una solicitud de patente que había presentado MilliporeSigma. En agosto de 2017, la situación de las patentes en Europa era compleja, con MilliporeSigma, ToolGen, la Universidad de Vilnius y Harvard compitiendo por reclamos, junto con la Universidad de California y Broad.

En julio de 2018, el TJUE dictaminó que la edición de genes para plantas era una subcategoría de los alimentos transgénicos y, por lo tanto, la técnica CRISPR en lo sucesivo estaría regulada en la Unión Europea por sus normas y reglamentos para transgénicos.

En febrero de 2020, un ensayo en EE. UU. mostró de manera segura la edición de genes CRISPR en tres pacientes con cáncer.

En octubre de 2020, las investigadoras Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna recibieron el Premio Nobel de Química por su trabajo en este campo. Hicieron historia como las dos primeras mujeres en compartir este premio sin un colaborador masculino.

En junio de 2021, el primer ensayo clínico pequeño de edición de genes CRISPR intravenoso en humanos concluye con resultados prometedores.

En septiembre de 2021, el primer alimento editado con CRISPR salió a la venta pública en Japón. Los tomates fueron modificados genéticamente por alrededor de cinco veces la cantidad normal de GABA posiblemente calmante. CRISPR se aplicó por primera vez en tomates en 2014.

En diciembre de 2021, se informó que el primer animal marino/marisco editado con genes CRISPR y el segundo conjunto de alimentos editados con CRISPR salieron a la venta pública en Japón: dos peces de los cuales una especie crece al doble del tamaño de los especímenes naturales debido a la interrupción de la leptina, que controla el apetito, y el otro crece a 1.2 del tamaño promedio natural con la misma cantidad de alimentos debido a la miostatina desactivada, que inhibe el crecimiento muscular.

Un estudio de 2022 descubrió que saber más sobre los tomates CRISPR tuvo un fuerte efecto en la preferencia de los participantes. "Casi la mitad de los 32 participantes de Alemania que son científicos demostraron opciones constantes, mientras que la mayoría mostró una mayor disposición a comprar tomates CRISPR, en su mayoría no científicos".

Ingeniería del genoma

La edición del genoma CRISPR-Cas9 se lleva a cabo con un sistema CRISPR Tipo II. Cuando se utiliza para la edición del genoma, este sistema incluye Cas9, crRNA y tracrRNA junto con una sección opcional de plantilla de reparación de ADN que se utiliza en la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o en la reparación dirigida por homología (HDR).

Componentes mayores

CRISPR-Cas9 a menudo emplea un plásmido para transfectar las células objetivo. Los componentes principales de este plásmido se muestran en la imagen y se enumeran en la tabla. El crRNA está diseñado exclusivamente para cada aplicación, ya que esta es la secuencia que utiliza Cas9 para identificar y unirse directamente a secuencias específicas dentro del ADN de la célula huésped. El crRNA debe unirse solo donde se desea la edición. La plantilla de reparación también está diseñada de manera única para cada aplicación, ya que debe complementar hasta cierto punto las secuencias de ADN en cualquier lado del corte y también contener cualquier secuencia que se desee para la inserción en el genoma del huésped.

Múltiples crRNA y el tracrRNA se pueden empaquetar juntos para formar un ARN de guía única (sgRNA). Este sgRNA puede incluirse junto con el gen que codifica la proteína Cas9 y convertirse en un plásmido para ser transfectado en células. Muchas herramientas en línea están disponibles para ayudar en el diseño de secuencias de sgRNA efectivas.

Alternativas a Cas9

Las proteínas alternativas a Cas9 incluyen las siguientes:

Estructura

CRISPR-Cas9 ofrece un alto grado de fidelidad y una construcción relativamente simple. Depende de dos factores para su especificidad: la secuencia diana y la secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM). La secuencia objetivo tiene una longitud de 20 bases como parte de cada locus CRISPR en la matriz crRNA. Una matriz típica de crRNA tiene múltiples secuencias objetivo únicas. Las proteínas Cas9 seleccionan la ubicación correcta en el genoma del huésped utilizando la secuencia para unirse con pares de bases en el ADN del huésped. La secuencia no forma parte de la proteína Cas9 y, como resultado, se puede personalizar y sintetizar de forma independiente.

Cas9 reconoce la secuencia PAM en el genoma del huésped. Cas9 no se puede modificar fácilmente para reconocer una secuencia PAM diferente. Sin embargo, en última instancia, esto no es demasiado limitante, ya que normalmente es una secuencia muy corta e inespecífica que ocurre con frecuencia en muchos lugares a lo largo del genoma (p. ej., la secuencia PAM de SpCas9 es 5'-NGG-3' y en el genoma humano ocurre aproximadamente cada 8 a 12 pares de bases).

Una vez que estas secuencias se ensamblaron en un plásmido y se transfectaron en células, la proteína Cas9 con la ayuda del crRNA encuentra la secuencia correcta en el ADN de la célula huésped y, dependiendo de la variante de Cas9, crea una ruptura de cadena simple o doble en la ubicación adecuada en el ADN.

Las roturas monocatenarias debidamente espaciadas en el ADN huésped pueden desencadenar una reparación dirigida por homología, que es menos propensa a errores que la unión de extremos no homólogos que normalmente sigue a una rotura de doble cadena. Proporcionar una plantilla de reparación de ADN permite la inserción de una secuencia de ADN específica en una ubicación exacta dentro del genoma. La plantilla de reparación debe extenderse de 40 a 90 pares de bases más allá de la rotura de ADN inducida por Cas9. El objetivo es que el proceso HDR nativo de la célula utilice la plantilla de reparación proporcionada y, por lo tanto, incorpore la nueva secuencia en el genoma. Una vez incorporada, esta nueva secuencia ahora es parte del material genético de la célula y pasa a sus células hijas.

Entrega

La entrega de Cas9, sgRNA y complejos asociados a las células puede ocurrir a través de sistemas virales y no virales. La electroporación de ADN, ARN o ribonucleocomplejos es una técnica común, aunque puede provocar efectos nocivos en las células diana. También se han utilizado técnicas de transfección química que utilizan lípidos y péptidos para introducir sgRNA en complejo con Cas9 en las células. La entrega basada en nanopartículas también se ha utilizado para la transfección. Los tipos de células que son más difíciles de transfectar (p. ej., células madre, neuronas y células hematopoyéticas) requieren sistemas de administración más eficientes, como los basados ​​en lentivirus (LV), adenovirus (AdV) y virus adenoasociados (AAV).

Se ha descubierto que la eficiencia de CRISPR-Cas9 aumenta considerablemente cuando varios componentes del sistema, incluida la estructura completa de CRISPR/Cas9 a los complejos Cas9-gRNA, se entregan en forma ensamblada en lugar de usar transgénicos. Esto ha encontrado un valor particular en los cultivos genéticamente modificados para la comercialización masiva. Dado que no se necesita la maquinaria de replicación del huésped para producir estas proteínas, la posibilidad de que la secuencia de reconocimiento del sgRNA sea casi nula, lo que reduce la posibilidad de efectos no deseados.

Edición controlada del genoma

Otras mejoras y variantes del sistema CRISPR-Cas9 se han centrado en introducir más control en su uso. Específicamente, la investigación dirigida a mejorar este sistema incluye mejorar su especificidad, su eficiencia y la granularidad de su poder de edición. Las técnicas se pueden dividir y clasificar además por el componente del sistema que modifican. Estos incluyen el uso de diferentes variantes o creaciones novedosas de la proteína Cas, el uso de una proteína efectora completamente diferente, la modificación del sgRNA o el uso de un enfoque algorítmico para identificar las soluciones óptimas existentes.

La especificidad es un aspecto importante para mejorar el sistema CRISPR-Cas9 porque los efectos fuera del objetivo que genera tienen graves consecuencias para el genoma de la célula y exige precaución para su uso. Minimizar los efectos fuera del objetivo es maximizar la seguridad del sistema. Las variaciones novedosas de las proteínas Cas9 que aumentan la especificidad incluyen proteínas efectoras con una eficiencia y especificidad comparables a las de la SpCas9 original que son capaces de dirigirse a las secuencias previamente no dirigidas y una variante que prácticamente no tiene mutaciones fuera del objetivo. También se han realizado investigaciones en la ingeniería de nuevas proteínas Cas9, incluidas algunas que reemplazan parcialmente los nucleótidos de ARN en crRNA con ADN y un procedimiento de generación de mutantes Cas9 guiado por la estructura que redujo los efectos fuera del objetivo.Se ha demostrado que los sgRNA iterativamente truncados y los gRNA altamente estabilizados también reducen los efectos fuera del objetivo. Se han utilizado métodos computacionales, incluido el aprendizaje automático, para predecir la afinidad y crear secuencias únicas para el sistema a fin de maximizar la especificidad para objetivos determinados.

Varias variantes de CRISPR-Cas9 permiten la activación de genes o la edición del genoma con un disparador externo como la luz o moléculas pequeñas. Estos incluyen sistemas CRISPR fotoactivables desarrollados mediante la fusión de proteínas sensibles a la luz con un dominio activador y un dCas9 para la activación de genes, o mediante la fusión de dominios sensibles a la luz similares con dos construcciones de split-Cas9, o mediante la incorporación de aminoácidos no naturales enjaulados en Cas9, o modificando los ARN guía con complementos fotoescindibles para la edición del genoma.

Los métodos para controlar la edición del genoma con moléculas pequeñas incluyen un Cas9 alostérico, sin edición de fondo detectable, que activará la unión y la escisión al agregar 4-hidroxitamoxifeno (4-HT), Cas9 ligado a inteína sensible a 4-HT, o un Cas9 que responde a 4-HT cuando se fusiona con cuatro dominios ERT2. El split-Cas9 inducible por inteína permite la dimerización de fragmentos Cas9 y el sistema split-Cas9 inducible por rapamicina desarrollado mediante la fusión de dos construcciones de split-Cas9 con fragmentos FRB y FKBP. Otros estudios han podido inducir la transcripción de Cas9 con una molécula pequeña, la doxiciclina. Las moléculas pequeñas también se pueden usar para mejorar la reparación dirigida por homología, a menudo mediante la inhibición de la vía de unión de extremos no homólogos.Se creó un sistema con la proteína efectora Cpf1 que es inducida por pequeñas moléculas VE-822 y AZD-7762. Estos sistemas permiten el control condicional de la actividad CRISPR para mejorar la precisión, la eficiencia y el control espaciotemporal. El control espaciotemporal es una forma de eliminar los efectos no deseados: solo es posible que sea necesario modificar ciertas células o partes del organismo y, por lo tanto, se pueden usar moléculas pequeñas o ligeras como una forma de realizar esto. La eficiencia del sistema CRISPR-Cas9 también aumenta considerablemente mediante la entrega adecuada de las instrucciones de ADN para crear las proteínas y los reactivos necesarios.

CRISPR también utiliza proteínas de edición de un solo par de bases para crear ediciones específicas en una o dos bases en la secuencia objetivo. CRISPR/Cas9 se fusionó con enzimas específicas que inicialmente solo podían cambiar las mutaciones C a T y G a A y su reverso. Esto se logró finalmente sin requerir ninguna escisión de ADN. Con la fusión de otra enzima, el sistema de edición de base CRISPR-Cas9 también puede editar C a G y su reverso.

Cribado CRISPR

El sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/Cas9 es una tecnología de edición de genes que puede inducir roturas de doble cadena (DSB) en cualquier lugar donde los ácidos ribonucleicos (ARNg) puedan unirse con la secuencia del motivo adyacente del protoespaciador (PAM). Los mutantes del sitio activo de Cas9 también pueden inducir muescas de una sola hebra, también conocidas como nickasas de Cas9. Simplemente cambiando la secuencia de gRNA, la endonucleasa Cas9 puede administrarse a un gen de interés e inducir DSB. La eficacia de la endonucleasa Cas9 y la facilidad con la que se pueden seleccionar los genes llevaron al desarrollo de bibliotecas CRISPR-knockout (KO) tanto para células de ratón como humanas, que pueden cubrir conjuntos de genes específicos de interés o el genoma completo.El cribado CRISPR ayuda a los científicos a crear una perturbación genética sistemática y de alto rendimiento dentro de organismos modelo vivos. Esta perturbación genética es necesaria para comprender completamente la función de los genes y la regulación epigenética. La ventaja de las bibliotecas CRISPR agrupadas es que se pueden seleccionar más genes a la vez.

Las bibliotecas knock-out se crean de manera que se logre la misma representación y rendimiento en todos los ARNg expresados ​​y llevan un marcador de selección antibiótico o fluorescente que se puede usar para recuperar las células transducidas. Hay dos sistemas de plásmidos en las bibliotecas CRISPR/Cas9. Primero, está todo en un plásmido, donde sgRNA y Cas9 se producen simultáneamente en una célula transfectada. En segundo lugar, es un sistema de dos vectores: los plásmidos sgRNA y Cas9 se entregan por separado. Es importante entregar miles de vectores únicos que contienen sgRNA a un solo recipiente de células por transducción viral a una baja multiplicidad de infección (MOI, típicamente en 0.1-0.6), evita la probabilidad de que un clon de célula individual obtenga más de un tipo de sgRNA, de lo contrario, puede conducir a una asignación incorrecta de genotipo a fenotipo.

Una vez que se prepara la biblioteca agrupada, es necesario llevar a cabo una secuenciación profunda (NGS, secuenciación de próxima generación) del ADN del plásmido amplificado por PCR para revelar la abundancia de sgRNA. Las células de interés pueden infectarse consecuentemente por la biblioteca y luego seleccionarse según el fenotipo. Hay 2 tipos de selección: negativa y positiva. Mediante selección negativa se detectan eficientemente células muertas o de crecimiento lento. Puede identificar genes esenciales para la supervivencia, que pueden servir como candidatos para fármacos dirigidos molecularmente. Por otro lado, la selección positiva da una colección de poblaciones adquiridas con ventaja de crecimiento por mutagénesis aleatoria.Después de la selección, el ADN genómico se recoge y secuencia mediante NGS. El agotamiento o el enriquecimiento de los sgRNA se detectan y comparan con la biblioteca original de sgRNA, anotados con el gen objetivo al que corresponde el sgRNA. Luego, el análisis estadístico identifica los genes que tienen una probabilidad significativa de ser relevantes para el fenotipo de interés.

Además del knock-out, también hay bibliotecas de knock-down (CRISPRi) y activación (CRISPRa), que utilizan la capacidad de las proteínas de fusión Cas9 desactivadas proteolíticamente (dCas9) para unirse al ADN objetivo, lo que significa que el gen de interés no se corta sino está sobreexpresada o reprimida. Hizo que el sistema CRISPR/Cas9 fuera aún más interesante en la edición de genes. La proteína dCas9 inactiva modula la expresión génica dirigiendo los represores o activadores de dCas9 hacia el promotor o los sitios de inicio de la transcripción de los genes diana. Para reprimir los genes, Cas9 se puede fusionar con el dominio efector KRAB que forma un complejo con gRNA, mientras que CRISPRa utiliza dCas9 fusionado con diferentes dominios de activación transcripcional, que son dirigidos por gRNA a las regiones promotoras para regular al alza la expresión.

Aplicaciones

Modelos de enfermedades

La modificación genómica Cas9 ha permitido la generación rápida y eficiente de modelos transgénicos dentro del campo de la genética. Cas9 se puede introducir fácilmente en las células objetivo junto con sgRNA a través de la transfección de plásmidos para modelar la propagación de enfermedades y la respuesta y defensa de la célula contra la infección. La capacidad de Cas9 para introducirse in vivo permite la creación de modelos más precisos de la función de los genes y los efectos de las mutaciones, al mismo tiempo que evita las mutaciones fuera del objetivo que normalmente se observan con los métodos más antiguos de ingeniería genética.

La revolución CRISPR y Cas9 en el modelado genómico no se extiende solo a los mamíferos. Los modelos genómicos tradicionales como Drosophila melanogaster, uno de los primeros organismos modelo, han experimentado un mayor refinamiento en su resolución con el uso de Cas9. Cas9 utiliza promotores específicos de células que permiten un uso controlado de Cas9. Cas9 es un método preciso para tratar enfermedades debido a que la enzima Cas9 solo afecta a ciertos tipos de células. Las células que se someten a la terapia Cas9 también se pueden eliminar y reintroducir para proporcionar efectos amplificados de la terapia.

CRISPR-Cas9 se puede utilizar para editar el ADN de organismos in vivo y para eliminar genes individuales o incluso cromosomas completos de un organismo en cualquier punto de su desarrollo. Los cromosomas que se han eliminado con éxito in vivo utilizando técnicas CRISPR incluyen el cromosoma Y y el cromosoma X de ratones de laboratorio adultos y los cromosomas humanos 14 y 21, en líneas de células madre embrionarias y ratones aneuploides, respectivamente. Este método podría ser útil para tratar trastornos genéticos causados ​​por un número anormal de cromosomas, como el síndrome de Down y los trastornos intersexuales.

La edición exitosa del genoma in vivo con CRISPR-Cas9 se ha demostrado en numerosos organismos modelo, incluidos Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis spp., Danio rerio y Mus musculus. Se han logrado éxitos en el estudio de la biología básica, en la creación de modelos de enfermedades y en el tratamiento experimental de modelos de enfermedades.

Han surgido preocupaciones de que los efectos fuera del objetivo (edición de genes además de los previstos) pueden confundir los resultados de un experimento de edición de genes CRISPR (es decir, el cambio fenotípico observado puede no deberse a la modificación del gen objetivo, sino de algún otro gen). Se han realizado modificaciones a CRISPR para minimizar la posibilidad de efectos fuera del objetivo. Los experimentos CRISPR ortogonales a menudo se recomiendan para confirmar los resultados de un experimento de edición de genes.

CRISPR simplifica la creación de organismos genéticamente modificados para la investigación que simulan enfermedades o muestran lo que sucede cuando un gen es anulado o mutado. CRISPR se puede usar a nivel de línea germinal para crear organismos en los que el gen objetivo cambia en todas partes (es decir, en todas las células/tejidos/órganos de un organismo multicelular), o se puede usar en células que no son de línea germinal para crear cambios locales que solo afectar ciertas poblaciones de células dentro del organismo.

CRISPR se puede utilizar para crear modelos celulares humanos de enfermedades. Por ejemplo, cuando se aplica a células madre pluripotentes humanas, CRISPR se ha utilizado para introducir mutaciones específicas en genes relevantes para la poliquistosis renal (PKD) y la glomeruloesclerosis focal y segmentaria (FSGS). Estas células madre pluripotentes modificadas con CRISPR se cultivaron posteriormente en organoides de riñón humano que exhibían fenotipos específicos de la enfermedad. Los organoides renales de las células madre con mutaciones PKD formaron grandes estructuras de quistes translúcidos a partir de los túbulos renales. Los quistes eran capaces de alcanzar dimensiones macroscópicas, de hasta un centímetro de diámetro.Los organoides renales con mutaciones en un gen relacionado con la FSGS desarrollaron defectos de unión entre los podocitos, las células filtrantes afectadas en esa enfermedad. Esto se atribuyó a la incapacidad de los podocitos para formar microvellosidades entre células adyacentes. Es importante destacar que estos fenotipos de enfermedades estaban ausentes en los organoides de control de antecedentes genéticos idénticos, pero carecían de las modificaciones CRISPR.

Se tomó un enfoque similar para modelar el síndrome de QT largo en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes. Estos modelos celulares generados por CRISPR, con controles isogénicos, brindan una nueva forma de estudiar enfermedades humanas y probar medicamentos.

Biomedicina

La tecnología CRISPR-Cas se ha propuesto como tratamiento para múltiples enfermedades humanas, especialmente aquellas de causa genética. Su capacidad para modificar secuencias de ADN específicas lo convierte en una herramienta con potencial para corregir mutaciones que causan enfermedades. Las primeras investigaciones en modelos animales sugieren que las terapias basadas en la tecnología CRISPR tienen potencial para tratar una amplia variedad de enfermedades, como el cáncer, la progeria, la talasemia beta, la enfermedad de células falciformes, la hemofilia, la fibrosis quística, la distrofia muscular de Duchenne, la enfermedad de Huntington, la amiloidosis por transtiretina y enfermedad del corazón. CRISPR también se ha utilizado para curar la malaria en mosquitos, lo que podría eliminar el vector y la enfermedad en humanos.CRISPR también puede tener aplicaciones en la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa, como la creación de vasos sanguíneos humanos que carecen de expresión de proteínas MHC de clase II, que a menudo causan el rechazo de trasplantes.

Además, los ensayos clínicos para curar la beta talasemia y la enfermedad de células falciformes en pacientes humanos utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 han mostrado resultados prometedores.

Ceguera

El tratamiento CRISPR para LCA10 (la variante más común de la amaurosis congénita de Leber, que es la principal causa de ceguera infantil hereditaria) modifica el gen fotorreceptor defectuoso del paciente.

En marzo de 2020, el primer paciente voluntario en este estudio con sede en EE. UU., patrocinado por Editas Medicine, recibió una dosis baja del tratamiento para probar la seguridad.

En junio de 2021, comenzó la inscripción para una cohorte pediátrica y adulta de dosis alta de 4 pacientes voluntarios cada una. Se espera que la dosificación de las nuevas cohortes se complete en julio de 2022.

Cáncer

CRISPR también ha encontrado muchas aplicaciones en el desarrollo de inmunoterapias basadas en células. El primer ensayo clínico que involucró a CRISPR comenzó en 2016. Involucró tomar células inmunes de personas con cáncer de pulmón, usar CRISPR para editar el gen expresado PD-1 y luego administrar las células alteradas a la misma persona. Otros 20 ensayos estaban en marcha o casi listos, principalmente en China, a partir de 2017.

En 2016, la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) aprobó un ensayo clínico en el que se usaría CRISPR para alterar las células T extraídas de personas con diferentes tipos de cáncer y luego administrar esas células T modificadas a las mismas personas.

En noviembre de 2020, en modelos animales con ratones, CRISPR se usó de manera eficaz para tratar el glioblastoma (tumor cerebral de crecimiento rápido) y el cáncer de ovario metastásico, ya que son dos tipos de cáncer con algunos de los peores pronósticos y generalmente se diagnostican durante sus últimas etapas.. Los tratamientos dieron como resultado la inhibición del crecimiento tumoral y aumentaron la supervivencia en un 80 % para el cáncer de ovario metastásico y la apoptosis de las células tumorales, inhibieron el crecimiento tumoral en un 50 % y mejoraron la supervivencia en un 30 % para el glioblastoma.

En octubre de 2021, CRISPR Therapeutics anunció los resultados de su ensayo de fase 1 en curso en los EE. UU. para una terapia de células T alogénicas. Estas células provienen de donantes sanos y se editan para atacar las células cancerosas y evitar que el sistema inmunitario del receptor las vea como una amenaza, y luego se multiplican en lotes enormes que se pueden administrar a un gran número de receptores.

Diabetes

La diabetes tipo 1 es un trastorno endocrino que resulta de la falta de células beta pancreáticas para producir insulina, un compuesto vital en el transporte de azúcar en la sangre a las células para producir energía. Los investigadores han estado tratando de trasplantar células beta sanas. CRISPR se utiliza para editar las células con el fin de reducir la posibilidad de que el cuerpo del paciente rechace el trasplante.

En febrero de 2022, se realizó un ensayo de fase 1 en el que un paciente voluntario recibió tratamiento.

VIH/SIDA

El virus de la inmunodeficiencia humana o VIH, es un virus que ataca el sistema inmunológico del organismo. Si bien existen tratamientos efectivos que pueden permitir que los pacientes lleven vidas saludables, el VIH es retroactivo, lo que significa que incorpora una versión inactiva de sí mismo en el genoma humano. CRISPR se puede utilizar para eliminar selectivamente el virus del genoma mediante el diseño de ARN guía para apuntar al genoma retroactivo del VIH. Un problema con este enfoque es que requiere la eliminación del genoma del VIH de casi todas las células, lo que puede ser difícil de lograr de manera realista.

Infección

Las "nucleasas guiadas por ARN" basadas en CRISPR-Cas se pueden usar para apuntar a factores de virulencia, genes que codifican la resistencia a los antibióticos y otras secuencias médicamente relevantes de interés. Por lo tanto, esta tecnología representa una nueva forma de terapia antimicrobiana y una estrategia para manipular las poblaciones bacterianas. Estudios recientes sugieren una correlación entre la interferencia del locus CRISPR-Cas y la adquisición de resistencia a los antibióticos. Este sistema brinda protección a las bacterias contra la invasión de ADN extraño, como transposones, bacteriófagos y plásmidos. Este sistema demostró ser una fuerte presión selectiva para la adquisición de resistencia a antibióticos y factor de virulencia en patógenos bacterianos.

Las terapias basadas en la tecnología de edición de genes CRISPR-Cas3 proporcionada por bacteriófagos diseñados podrían usarse para destruir el ADN objetivo en los patógenos. Cas3 es más destructivo que el más conocido Cas9.

La investigación sugiere que CRISPR es una forma efectiva de limitar la replicación de múltiples herpesvirus. Fue capaz de erradicar el ADN viral en el caso del virus de Epstein-Barr (EBV). Los CRISPR contra el herpesvirus tienen aplicaciones prometedoras, como eliminar el EBV que causa cáncer de las células tumorales, ayudar a eliminar los invasores virales de los órganos donados para pacientes inmunocomprometidos o prevenir los brotes de herpes labial y las infecciones oculares recurrentes al bloquear la reactivación del HSV-1. En agosto de 2016, estaban a la espera de ser probados.

Los resultados iniciales en el tratamiento y cura del VIH han sido bastante exitosos, en 2021 9 de 23 ratones humanizados tratados con una combinación de antirretrovirales y CRISPR/Cas-9 que hacen que el virus se vuelva indetectable, incluso después del período de rebote habitual.. Ninguno de los dos tratamientos por sí solo tuvo tal efecto. Los ensayos clínicos en humanos comenzarán en 2022.

CRISPR puede revivir el concepto de trasplante de órganos animales en personas. Los retrovirus presentes en los genomas animales podrían dañar a los receptores de trasplantes. En 2015, un equipo eliminó 62 copias de una secuencia de ADN retroviral particular del genoma de cerdo en una célula epitelial de riñón. Los investigadores demostraron recientemente la capacidad de dar a luz muestras de cerdos vivos después de eliminar estos retrovirus de su genoma utilizando CRISPR por primera vez.

Derribo/activación

El uso de versiones "muertas" de Cas9 (dCas9) elimina la capacidad de corte de ADN de CRISPR, al tiempo que preserva su capacidad para apuntar a secuencias deseables. Múltiples grupos agregaron varios factores reguladores a dCas9s, lo que les permitió activar o desactivar casi cualquier gen o ajustar su nivel de actividad.Al igual que el RNAi, la interferencia CRISPR (CRISPRi) desactiva los genes de manera reversible al apuntar, pero no cortar un sitio. El sitio objetivo está metilado, modificando epigenéticamente el gen. Esta modificación inhibe la transcripción. Estas modificaciones colocadas con precisión pueden usarse para regular los efectos sobre las expresiones génicas y la dinámica del ADN después de la inhibición de ciertas secuencias genómicas dentro del ADN. En los últimos años, las marcas epigenéticas en diferentes células humanas se han investigado de cerca y se ha encontrado que ciertos patrones dentro de las marcas se correlacionan con todo, desde el crecimiento tumoral hasta la actividad cerebral. Por el contrario, la activación mediada por CRISPR (CRISPRa) promueve la transcripción de genes. Cas9 es una forma efectiva de apuntar y silenciar genes específicos a nivel de ADN.En las bacterias, la sola presencia de Cas9 es suficiente para bloquear la transcripción. Para aplicaciones en mamíferos, se agrega una sección de proteína. Su ARN guía se dirige a secuencias de ADN reguladoras llamadas promotores que preceden inmediatamente al gen objetivo.

Cas9 se utilizó para transportar factores de transcripción sintéticos que activaban genes humanos específicos. La técnica logró un fuerte efecto al dirigir múltiples construcciones CRISPR a ubicaciones ligeramente diferentes en el promotor del gen.

Edición de ARN

En 2016, los investigadores demostraron que CRISPR de una bacteria bucal común podría usarse para editar ARN. Los investigadores buscaron en bases de datos que contenían cientos de millones de secuencias genéticas aquellas que se parecían a los genes CRISPR. Consideraron la fusobacterium Leptotrichia shahii. Tenía un grupo de genes que se parecían a los genes CRISPR, pero con diferencias importantes. Cuando los investigadores equiparon a otras bacterias con estos genes, a los que llamaron C2c2, descubrieron que los organismos obtuvieron una nueva defensa. Posteriormente, C2c2 pasó a llamarse Cas13a para ajustarse a la nomenclatura estándar de los genes Cas.

Muchos virus codifican su información genética en ARN en lugar de ADN que reutilizan para crear nuevos virus. El VIH y el poliovirus son tales virus. Las bacterias con Cas13 producen moléculas que pueden desmembrar el ARN y destruir el virus. Adaptar estos genes abrió cualquier molécula de ARN a la edición.

Los sistemas CRISPR-Cas también se pueden emplear para editar genes de micro-ARN y ARN no codificante largo en plantas.

Impulsor genético

Los impulsores genéticos pueden proporcionar una herramienta poderosa para restablecer el equilibrio de los ecosistemas mediante la eliminación de especies invasoras. Se han planteado preocupaciones con respecto a la eficacia, las consecuencias no deseadas en las especies de destino, así como las especies no objetivo, en particular en el potencial de liberación accidental de los laboratorios a la naturaleza. Los científicos han propuesto varias medidas de seguridad para garantizar la contención de los impulsores genéticos experimentales, incluidos los moleculares, reproductivos y ecológicos. Muchos recomiendan que las unidades de inmunización y reversión se desarrollen junto con las unidades genéticas para anular sus efectos si es necesario. Persiste el consenso de que los efectos a largo plazo deben estudiarse más a fondo, particularmente en el potencial de perturbación ecológica que no puede corregirse con impulsos de reversión.

Agotamiento genético in vitro

Las bibliotecas de secuenciación no enriquecidas a menudo tienen abundantes secuencias no deseadas. Cas9 puede agotar específicamente las secuencias no deseadas con rotura de doble cadena con una eficiencia de hasta el 99 % y sin efectos secundarios significativos como se observa con las enzimas de restricción. El tratamiento con Cas9 puede agotar abundante ARNr al tiempo que aumenta la sensibilidad a patógenos en las bibliotecas de ARN-seq.

Primera edición

La edición principal (o edición básica) es un refinamiento CRISPR para insertar o eliminar con precisión secciones de ADN. Las ediciones CRISPR no siempre son perfectas y los cortes pueden terminar en el lugar equivocado. Ambas cuestiones son un problema para el uso de la tecnología en medicina. La edición principal no corta el ADN de doble cadena, sino que utiliza el aparato de orientación CRISPR para transportar una enzima adicional a una secuencia deseada, donde convierte un solo nucleótido en otro. La nueva guía, llamada pegRNA, contiene una plantilla de ARN para agregar una nueva secuencia de ADN al genoma en la ubicación de destino. Eso requiere una segunda proteína, unida a Cas9: una enzima transcriptasa inversa, que puede producir una nueva hebra de ADN a partir de la plantilla de ARN e insertarla en el sitio cortado.Esos tres eventos de emparejamiento independientes brindan la oportunidad de evitar secuencias fuera del objetivo, lo que aumenta significativamente la flexibilidad de orientación y la precisión de edición. La edición principal fue desarrollada por investigadores del Instituto Broad del MIT y Harvard en Massachusetts. Se necesita más trabajo para optimizar los métodos.

Sociedad y Cultura

Modificación de la línea germinal humana

En marzo de 2015, varios grupos habían anunciado investigaciones en curso con la intención de sentar las bases para aplicar CRISPR a embriones humanos para la ingeniería de la línea germinal humana, incluidos laboratorios en los EE. UU., China y el Reino Unido, así como la empresa biotecnológica estadounidense OvaScience. Los científicos, incluido un co-descubridor de CRISPR, instaron a una moratoria mundial sobre la aplicación de CRISPR a la línea germinal humana, especialmente para uso clínico. Dijeron que "los científicos deberían evitar incluso intentar, en jurisdicciones laxas, la modificación del genoma de la línea germinal para su aplicación clínica en humanos" hasta que las implicaciones completas "se discutan entre las organizaciones científicas y gubernamentales".

En abril de 2015, científicos chinos informaron los resultados de un intento de alterar el ADN de embriones humanos no viables utilizando CRISPR para corregir una mutación que causa la beta talasemia, un trastorno hereditario letal. El estudio había sido rechazado previamente tanto por Nature como por Science en parte debido a preocupaciones éticas. Los experimentos dieron como resultado cambiar con éxito solo algunos de los genes previstos y tuvieron efectos fuera del objetivo en otros genes. Los investigadores afirmaron que CRISPR no está listo para su aplicación clínica en medicina reproductiva.En abril de 2016, se informó que científicos chinos realizaron un segundo intento fallido de alterar el ADN de embriones humanos no viables usando CRISPR, esta vez para alterar el gen CCR5 para hacer que el embrión fuera resistente a la infección por VIH.

En diciembre de 2015, se llevó a cabo en Washington una cumbre internacional sobre edición de genes humanos bajo la dirección de David Baltimore. Miembros de academias científicas nacionales de EE. UU., Reino Unido y China discutieron la ética de la modificación de la línea germinal. Acordaron apoyar la investigación básica y clínica bajo ciertas pautas legales y éticas. Se hizo una distinción específica entre las células somáticas, donde los efectos de las ediciones se limitan a un solo individuo, y las células germinales, donde los cambios en el genoma pueden ser heredados por los descendientes. Las modificaciones heredables podrían tener consecuencias imprevistas y de gran alcance para la evolución humana, genéticamente (p. ej., interacciones entre genes y medio ambiente) y culturalmente (p. ej., el darwinismo social). Se definió como irresponsable la alteración de gametocitos y embriones para generar cambios hereditarios en humanos.

En febrero de 2017, el Comité de Edición de Genes Humanos de las Academias Nacionales de Ciencias, Ingeniería y Medicina de los Estados Unidos (NASEM, por sus siglas en inglés) publicó un informe que revisa las preocupaciones éticas, legales y científicas de la tecnología de ingeniería genómica. La conclusión del informe indicó que la edición hereditaria del genoma no está permitida ahora, pero podría justificarse para ciertas condiciones médicas; sin embargo, no justificaron el uso de CRISPR para la mejora.

En noviembre de 2018, Jiankui anunció que había editado dos embriones humanos para intentar desactivar el gen CCR5, que codifica un receptor que el VIH usa para ingresar a las células. Dijo que las gemelas, Lulu y Nana, habían nacido unas semanas antes. Dijo que las niñas aún portaban copias funcionales de CCR5 junto con CCR5 desactivado (mosaicismo) y aún eran vulnerables al VIH. El trabajo fue ampliamente condenado como poco ético, peligroso y prematuro. Un grupo internacional de científicos pidió una moratoria mundial sobre la edición genética de embriones humanos.

Obstáculos políticos a la ingeniería genética

Las regulaciones de política para el sistema CRISPR-Cas9 varían en todo el mundo. En febrero de 2016, los reguladores dieron permiso a científicos británicos para modificar genéticamente embriones humanos mediante el uso de CRISPR-Cas9 y técnicas relacionadas. Sin embargo, a los investigadores se les prohibió implantar los embriones y los embriones debían destruirse después de siete días.

Estados Unidos tiene un elaborado sistema regulatorio interdepartamental para evaluar nuevos alimentos y cultivos genéticamente modificados. Por ejemplo, la Ley de Protección de Riesgos Agrícolas de 2000 otorga al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos la autoridad para supervisar la detección, el control, la erradicación, la supresión, la prevención o el retraso de la propagación de plagas de plantas o malas hierbas nocivas para proteger la agricultura, el medio ambiente, y la economía de los EE. La ley regula cualquier organismo genéticamente modificado que utilice el genoma de una "plaga vegetal" predefinida o cualquier planta no categorizada previamente.En 2015, Yinong Yang desactivó con éxito 16 genes específicos en el champiñón blanco para que no se oscurezcan. Dado que no había agregado ADN de especies extrañas (transgénico) a su organismo, el hongo no podía ser regulado por el USDA bajo la Sección 340.2. El champiñón blanco de Yang fue el primer organismo modificado genéticamente con el sistema de proteína CRISPR-Cas9 en pasar la regulación estadounidense.

En 2016, el USDA patrocinó un comité para considerar la futura política regulatoria para las próximas técnicas de modificación genética. Con la ayuda de las Academias Nacionales de Ciencias, Ingeniería y Medicina de EE. UU., los grupos de intereses especiales se reunieron el 15 de abril para contemplar los posibles avances en ingeniería genética dentro de los próximos cinco años y las nuevas regulaciones que podrían ser necesarias como resultado. En 2017, la Administración de Alimentos y Medicamentos propuso una regla que clasificaría las modificaciones de ingeniería genética en animales como "medicamentos para animales", sometiéndolas a una regulación estricta si se ofrecen a la venta y reduciendo la capacidad de las personas y las pequeñas empresas para hacerlas rentables.

En China, donde las condiciones sociales contrastan marcadamente con las de Occidente, las enfermedades genéticas conllevan un fuerte estigma. Esto deja a China con menos barreras políticas para el uso de esta tecnología.

Reconocimiento

En 2012 y 2013, CRISPR fue finalista en el premio Avance del año de la revista Science. En 2015, fue el ganador de ese premio. CRISPR fue nombrada una de las 10 tecnologías innovadoras de MIT Technology Review en 2014 y 2016. En 2016, Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier, junto con Rudolph Barrangou, Philippe Horvath y Feng Zhang ganaron el premio Gairdner International. En 2017, Doudna y Charpentier recibieron el Premio de Japón en Tokio, Japón, por su revolucionario invento de CRISPR-Cas9. En 2016, Charpentier, Doudna y Zhang ganaron el Premio Tang en Ciencias Biofarmacéuticas.En 2020, Charpentier y Doudna recibieron el Premio Nobel de Química, el primer premio de este tipo para un equipo exclusivamente femenino, "por el desarrollo de un método para la edición del genoma".