Dihidrofolato reductasa
La dihidrofolato reductasa, o DHFR, es una enzima que reduce el ácido dihidrofólico a ácido tetrahidrofólico, utilizando NADPH como donante de electrones, que se puede convertir en los tipos de tetrahidrofolato cofactores utilizados en la química de transferencia de 1 carbono. En humanos, la enzima DHFR está codificada por el gen DHFR. Se encuentra en la región q14.1 del cromosoma 5.
Hay dos clases estructurales de DHFR, evolutivamente no relacionadas entre sí. El primero generalmente se llama DHFR y se encuentra en cromosomas bacterianos y animales. Sin embargo, en las bacterias, la presión de los antibióticos ha provocado que esta clase evolucione con diferentes patrones de unión de moléculas diaminoheterocíclicas, lo que lleva a muchos "tipos" de bacterias. nombrados bajo esta clase, mientras que los mamíferos siguen siendo muy similares. El último (tipo II), representado por el R67 codificado por plástidos, es una pequeña enzima que funciona formando un homotetrámero.
Función
La dihidrofolato reductasa convierte el dihidrofolato en tetrahidrofolato, un transbordador de protones necesario para la síntesis de novo de purinas, ácido timidílico y ciertos aminoácidos. Si bien el gen funcional de la dihidrofolato reductasa se ha mapeado en el cromosoma 5, se han identificado múltiples pseudogenes procesados sin intrones o genes similares a la dihidrofolato reductasa en cromosomas separados.
Reacción catalizada por DHFR.
Vía de síntesis de tetrahidrofolate.
Encontrado en todos los organismos, DHFR tiene un papel fundamental en la regulación de la cantidad de tetrahidrofolato en la célula. El tetrahidrofolato y sus derivados son esenciales para la síntesis de purina y timidilato, que son importantes para la proliferación celular y el crecimiento celular. DHFR juega un papel central en la síntesis de precursores de ácidos nucleicos, y se ha demostrado que las células mutantes que carecen por completo de DHFR requieren glicina, una purina y timidina para crecer. También se ha demostrado que DHFR es una enzima involucrada en la recuperación de tetrahidrobiopterina de dihidrobiopterina.
Estructura
Una hoja plegada beta central de ocho hebras constituye la característica principal del plegamiento del esqueleto polipeptídico de DHFR. Siete de estos hilos son paralelos y el octavo es antiparalelo. Cuatro hélices alfa conectan hebras beta sucesivas. Los residuos 9 – 24 se denominan "Met20" o "bucle 1" y, junto con otros bucles, forman parte del subdominio principal que rodea el sitio activo. El sitio activo está situado en la mitad N-terminal de la secuencia, que incluye un dipéptido Pro-Trp conservado; se ha demostrado que el triptófano está implicado en la unión del sustrato por la enzima.
Mecanismo
Mecanismo general
DHFR cataliza la transferencia de un hidruro de NADPH a dihidrofolato con una protonación que lo acompaña para producir tetrahidrofolato. Al final, el dihidrofolato se reduce a tetrahidrofolato y el NADPH se oxida a NADP+. La alta flexibilidad de Met20 y otros bucles cerca del sitio activo desempeñan un papel en la promoción de la liberación del producto tetrahidrofolato. En particular, el bucle Met20 ayuda a estabilizar el anillo de nicotinamida del NADPH para promover la transferencia del hidruro de NADPH al dihidrofolato.
El mecanismo de esta enzima es escalonado y aleatorio en estado estacionario. Específicamente, la reacción catalítica comienza cuando el NADPH y el sustrato se unen al sitio de unión de la enzima, seguido de la protonación y la transferencia de hidruro del cofactor NADPH al sustrato. Sin embargo, los dos últimos pasos no tienen lugar simultáneamente en un mismo estado de transición. En un estudio que utiliza enfoques computacionales y experimentales, Liu et al concluye que el paso de protonación precede a la transferencia de hidruro.
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Se ha demostrado que el mecanismo enzimático de DHFR depende del pH, en particular el paso de transferencia de hidruro, ya que se ha demostrado que los cambios de pH tienen una influencia notable en la electrostática del sitio activo y el estado de ionización de sus residuos. La acidez del nitrógeno objetivo en el sustrato es importante en la unión del sustrato al sitio de unión de la enzima, que ha demostrado ser hidrofóbico a pesar de que tiene contacto directo con el agua. Asp27 es el único residuo hidrófilo cargado en el sitio de unión y la neutralización de la carga en Asp27 puede alterar el pKa de la enzima. Asp27 juega un papel crítico en el mecanismo catalítico ayudando con la protonación del sustrato y restringiendo el sustrato en la conformación favorable para la transferencia de hidruro. Se muestra que el paso de protonación está asociado con la tautomerización del enol, aunque esta conversión no se considera favorable para la donación de protones. Se demuestra que una molécula de agua está involucrada en el paso de protonación. El bucle Met20 facilita la entrada de la molécula de agua al sitio activo de la enzima.
Cambios conformacionales de DHFR
El ciclo catalítico de la reacción catalizada por DHFR incorpora cinco intermediarios importantes: holoenzima (E:NADPH), complejo de Michaelis (E:NADPH:DHF), complejo de producto ternario (E:NADP+: THF), complejo binario de tetrahidrofolato (E:THF) y complejo THF‚NADPH (E:NADPH:THF). El paso de disociación del producto (THF) de E:NADPH:THF a E:NADPH es el paso que determina la velocidad durante la rotación en estado estacionario.
Los cambios conformacionales son críticos en el mecanismo catalítico de DHFR. El bucle Met20 de DHFR puede abrir, cerrar u ocluir el sitio activo. En consecuencia, se asignan a Met20 tres conformaciones diferentes clasificadas como estados abierto, cerrado y ocluido. Además, se definió una conformación extra distorsionada de Met20 debido a sus resultados de caracterización indistintos. El bucle Met20 se observa en su conformación ocluida en los tres productos intermedios de ligadura, donde el anillo de nicotinamida está ocluido del sitio activo. Esta característica conformacional explica el hecho de que la sustitución de NADP+ por NADPH es anterior a la disociación del producto. Por lo tanto, la siguiente ronda de reacción puede ocurrir con la unión del sustrato.
R67 DHFR
Debido a su estructura única y características catalíticas, el R67 DHFR está ampliamente estudiado. R67 DHFR es un DHFR codificado por plásmido R de tipo II sin relación genética o estructural con el DHFR cromosómico de E. coli. Es un homotetrámero que posee la simetría 222 con un solo poro de sitio activo que está expuesto al solvente. Esta simetría del sitio activo da como resultado el diferente modo de unión de la enzima: puede unirse con dos moléculas de dihidrofolato (DHF) con cooperatividad positiva o dos moléculas de NADPH con cooperatividad negativa, o un sustrato más uno, pero solo este último tiene la capacidad catalítica. actividad. En comparación con el DHFR cromosómico de E. coli, tiene una mayor Km en la unión de dihidrofolato (DHF) y NADPH. La cinética catalítica mucho más baja muestra que la transferencia de hidruro es el paso que determina la velocidad en lugar de la liberación del producto (THF).
En la estructura R67 DHFR, el homotetrámero forma un poro de sitio activo. En el proceso catalítico, DHF y NADPH ingresan al poro desde posiciones opuestas. La interacción de apilamiento π-π entre el anillo de nicotinamida de NADPH y el anillo de pteridina de DHF conecta estrechamente dos reactivos en el sitio activo. Sin embargo, la flexibilidad de la cola de p-aminobenzoilglutamato de DHF se observó tras la unión, lo que puede promover la formación del estado de transición.
Reaction Kinetics comparación entre E. coli DHFR(EcDHFR) y R67 DHFR
Estructura diferencia de unión de sustratos en EcDHFR y R67 DHFR
Importancia clínica
Las mutaciones de DHFR causan deficiencia de dihidrofolato reductasa, un raro error congénito autosómico recesivo del metabolismo del folato que provoca anemia megaloblástica, pancitopenia y deficiencia cerebral grave de folato. Estos problemas se pueden superar mediante la suplementación con una forma reducida de folato, generalmente ácido folínico.
Aplicaciones terapéuticas
DHFR es un objetivo farmacéutico atractivo para la inhibición debido a su papel fundamental en la síntesis de precursores de ADN (timina). El trimetoprim, un antibiótico, inhibe la DHFR bacteriana, mientras que el metotrexato, un agente de quimioterapia, inhibe la DHFR de los mamíferos. Sin embargo, se ha desarrollado resistencia contra algunos fármacos, como resultado de cambios mutacionales en la propia DHFR.
Cáncer
DHFR es responsable de los niveles de tetrahidrofolato en una célula, y la inhibición de DHFR puede limitar el crecimiento y la proliferación de células que son características del cáncer y las infecciones bacterianas. El metotrexato, un inhibidor competitivo de la DHFR, es uno de esos medicamentos contra el cáncer que inhibe la DHFR.
El folato es necesario para el crecimiento y la vía del metabolismo del folato es un objetivo en el desarrollo de tratamientos para el cáncer. DHFR es uno de esos objetivos. Se demostró que un régimen de fluorouracilo, doxorrubicina y metotrexato prolonga la supervivencia en pacientes con cáncer gástrico avanzado. Estudios adicionales sobre los inhibidores de DHFR pueden conducir a más formas de tratar el cáncer.
Infección
Las bacterias también necesitan DHFR para crecer y multiplicarse y, por lo tanto, los inhibidores selectivos de DHFR bacteriano han encontrado aplicación como agentes antibacterianos. Trimetoprim ha demostrado tener actividad contra una variedad de patógenos bacterianos Gram-positivos. Sin embargo, la resistencia a la trimetoprima y otros fármacos dirigidos a la DHFR puede surgir debido a una variedad de mecanismos, lo que limita el éxito de sus usos terapéuticos. La resistencia puede surgir de la amplificación del gen DHFR, mutaciones en DHFR, disminución en la captación de los fármacos, entre otros. Independientemente, trimetoprim y sulfametoxazol en combinación se han utilizado como agente antibacteriano durante décadas.
La pirimetamina es un agente antiprotozoario ampliamente utilizado.
Otras clases de compuestos que se dirigen a la DHFR en general, y a las DHFR bacterianas en particular, pertenecen a clases como diaminopteridinas, diaminotriazinas, diaminopirroloquinazolinas, estilbenos, chalconas, desoxibenzoínas, diaminoquinazolinas, diaminopirroloquinazolinas, por nombrar solo algunas.
Posible tratamiento contra el ántrax
La dihidrofolato reductasa de Bacillus anthracis (BaDHFR) es un objetivo farmacológico validado en el tratamiento de la enfermedad infecciosa, el ántrax. BaDHFR es menos sensible a los análogos de trimetoprima que la dihidrofolato reductasa de otras especies como Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae. Una alineación estructural de la dihidrofolato reductasa de las cuatro especies muestra que solo BaDHFR tiene la combinación de fenilalanina y tirosina en las posiciones 96 y 102, respectivamente.
La resistencia de BaDHFR a los análogos de la trimetoprima se debe a estos dos residuos (F96 e Y102), que también confieren una cinética y una eficacia catalítica mejoradas. La investigación actual utiliza mutantes del sitio activo en BaDHFR para guiar la optimización de los nuevos inhibidores antifolato.
Como herramienta de investigación
DHFR se ha utilizado como una herramienta para detectar interacciones proteína-proteína en un ensayo de complementación de fragmentos de proteína (PCA), utilizando un enfoque de proteína dividida.
Las células CHO que carecen de DHFR son la línea celular más utilizada para la producción de proteínas recombinantes. Estas células se transfectan con un plásmido que lleva el gen dhfr y el gen de la proteína recombinante en un único sistema de expresión, y luego se someten a condiciones selectivas en medio sin timidina. Solo sobreviven las células con el gen DHFR exógeno junto con el gen de interés. La suplementación de este medio con metotrexato, un inhibidor competitivo de DHFR, puede seleccionar aún más aquellas células que expresan los niveles más altos de DHFR y, por lo tanto, seleccionar a los principales productores de proteínas recombinantes.
Interacciones
Se ha demostrado que la dihidrofolato reductasa interactúa con GroEL y Mdm2.
Mapa interactivo de rutas
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- ^ El mapa interactivo se puede editar en WikiPathways: "FluoropyrimidineActivity_WP1601".
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