Desnaturalización (bioquímica)

Los efectos de la temperatura en la actividad de la enzima.
Top: aumentar la temperatura aumenta la tasa de reacción (coeficiente Q10).
Medio ambiente: la fracción de la enzima plegada y funcional disminuye por encima de su temperatura de desnaturalización.
Bottom: en consecuencia, la tasa óptima de reacción de una enzima es a temperatura intermedia.

En bioquímica, la desnaturalización es un proceso en el que las proteínas o los ácidos nucleicos pierden la estructura cuaternaria, la estructura terciaria y la estructura secundaria que están presentes en su estado nativo, mediante la aplicación de algún estrés o compuesto externo. como un ácido o base fuerte, una sal inorgánica concentrada, un solvente orgánico (por ejemplo, alcohol o cloroformo), agitación y radiación o calor. Si las proteínas en una célula viva se desnaturalizan, esto da como resultado la interrupción de la actividad celular y posiblemente la muerte celular. La desnaturalización de proteínas también es una consecuencia de la muerte celular. Las proteínas desnaturalizadas pueden exhibir una amplia gama de características, desde cambios conformacionales y pérdida de solubilidad hasta agregación debido a la exposición de grupos hidrofóbicos. La pérdida de solubilidad como resultado de la desnaturalización se denomina coagulación. Las proteínas desnaturalizadas pierden su estructura 3D y por lo tanto no pueden funcionar.

El plegamiento de proteínas es clave para determinar si una proteína globular o de membrana puede hacer su trabajo correctamente; debe doblarse en la forma correcta para que funcione. Sin embargo, los enlaces de hidrógeno, que juegan un papel importante en el plegamiento, son bastante débiles y, por lo tanto, se ven afectados fácilmente por el calor, la acidez, las concentraciones variables de sal y otros factores estresantes que pueden desnaturalizar la proteína. Esta es una de las razones por las que la homeostasis es fisiológicamente necesaria en muchas formas de vida.

Este concepto no está relacionado con el alcohol desnaturalizado, que es el alcohol que se ha mezclado con aditivos para que no sea apto para el consumo humano.

Ejemplos comunes

(Top) La proteína albumin en el huevo blanco sufre desnaturalización y pérdida de solubilidad cuando se cocina el huevo. (Bottom) Paperclips proporciona una analogía visual para ayudar con la conceptualización del proceso de desnaturalización.

Cuando los alimentos se cocinan, algunas de sus proteínas se desnaturalizan. Por eso los huevos cocidos se endurecen y la carne cocida se endurece.

Un ejemplo clásico de desnaturalización de las proteínas proviene de las claras de huevo, que suelen ser en gran parte albúminas de huevo en agua. Recién salidas de los huevos, las claras de huevo son transparentes y líquidas. La cocción de las claras térmicamente inestables las vuelve opacas, formando una masa sólida interconectada. La misma transformación se puede efectuar con un producto químico desnaturalizante. Verter las claras de huevo en un vaso de precipitados con acetona también hará que las claras de huevo se vuelvan translúcidas y sólidas. La piel que se forma en la leche cuajada es otro ejemplo común de proteína desnaturalizada. El aperitivo frío conocido como ceviche se prepara "cociendo" químicamente. pescados y mariscos crudos en una marinada ácida de cítricos, sin calor.

Desnaturalización de proteínas

Las proteínas desnaturalizadas pueden exhibir una amplia gama de características, desde la pérdida de solubilidad hasta la agregación de proteínas.

Las proteínas funcionales tienen cuatro niveles de organización estructural:

1. Estructura primaria: estructura lineal de aminoácidos en la cadena polipéptida
2. Estructura secundaria: enlaces de hidrógeno entre cadenas de grupo de péptidos en una hoja de alfa helix o beta
3. Estructura terciaria: estructura tridimensional de helijas alfa y helijas beta plegadas
4. Estructura cuaternaria: estructura tridimensional de polipéptidos múltiples y cómo encajan juntos

Proceso de desnaturalización:

1. Proteína funcional que muestra una estructura cuaternaria
2. Cuando se aplica calor altera los lazos intramoleculares de la proteína
3. Desplegamiento de los polipéptidos (aminoácidos)

Antecedentes

Las proteínas o polipéptidos son polímeros de aminoácidos. Una proteína es creada por ribosomas que "leen" El ARN que está codificado por codones en el gen y ensambla la combinación de aminoácidos necesaria a partir de la instrucción genética, en un proceso conocido como traducción. La hebra de proteína recién creada luego sufre una modificación postraduccional, en la que se agregan átomos o moléculas adicionales, por ejemplo, cobre, zinc o hierro. Una vez que se ha completado este proceso de modificación postraduccional, la proteína comienza a plegarse (a veces de forma espontánea y a veces con ayuda enzimática), enrollándose sobre sí misma de modo que los elementos hidrofóbicos de la proteína quedan enterrados en lo profundo de la estructura y los elementos hidrofílicos terminan en el afuera. La forma final de una proteína determina cómo interactúa con su entorno.

El plegamiento de proteínas consiste en un equilibrio entre una cantidad sustancial de interacciones intramoleculares débiles dentro de una proteína (interacciones hidrofóbicas, electrostáticas y de Van Der Waals) e interacciones proteína-disolvente. Como resultado, este proceso depende en gran medida del estado ambiental en el que reside la proteína. Estas condiciones ambientales incluyen, entre otras, la temperatura, la salinidad, la presión y los solventes que están involucrados. En consecuencia, cualquier exposición a estrés extremo (por ejemplo, calor o radiación, altas concentraciones de sales inorgánicas, ácidos y bases fuertes) puede interrumpir la interacción de una proteína e inevitablemente conducir a la desnaturalización.

Cuando se desnaturaliza una proteína, las estructuras secundaria y terciaria se alteran, pero los enlaces peptídicos de la estructura primaria entre los aminoácidos se mantienen intactos. Dado que todos los niveles estructurales de la proteína determinan su función, la proteína ya no puede realizar su función una vez que se ha desnaturalizado. Esto contrasta con las proteínas intrínsecamente no estructuradas, que se despliegan en su estado nativo, pero siguen siendo funcionalmente activas y tienden a plegarse al unirse a su objetivo biológico.

Cómo se produce la desnaturalización a niveles de estructura proteica

• In estructura cuadrienal denaturación, subunidades de proteínas se disocian y/o se interrumpe el arreglo espacial de subunidades de proteínas.
• Estructura terciaria la desnaturalización implica la perturbación de:
  • Covallent interactions between amino acid side-chains (such as disulfide bridges between cysteine groups)
  • Interacciones dipole-dipole no covalente entre cadenas laterales de aminoácidos polares (y el solvente circundante)
  • Van der Waals (dipolo inducido) interacciones entre las cadenas laterales de aminoácidos no polares.
• In Estructura secundaria la desnaturalización, las proteínas pierden todos los patrones de repetición regulares como los alfa-helices y las hojas beta-pletadas, y adoptan una configuración de bobina aleatoria.
• Estructura primaria, como la secuencia de aminoácidos mantenidos juntos por los enlaces de péptidos covalentes, no se interrumpe por la desnaturalización.

Pérdida de función

La mayoría de los sustratos biológicos pierden su función biológica cuando se desnaturalizan. Por ejemplo, las enzimas pierden su actividad porque los sustratos ya no pueden unirse al sitio activo y porque los residuos de aminoácidos involucrados en la estabilización de los sustratos' los estados de transición ya no están posicionados para poder hacerlo. El proceso de desnaturalización y la pérdida de actividad asociada se pueden medir utilizando técnicas como la interferometría de polarización dual, CD, QCM-D y MP-SPR.

Pérdida de actividad por metales pesados y metaloides

Al dirigirse a las proteínas, se sabe que los metales pesados interrumpen la función y la actividad que llevan a cabo las proteínas. Es importante tener en cuenta que los metales pesados se clasifican en categorías que consisten en metales de transición, así como una cantidad selecta de metaloide. Estos metales, cuando interactúan con proteínas plegadas nativas, tienden a desempeñar un papel en la obstrucción de su actividad biológica. Esta interferencia puede llevarse a cabo de un número diferente de formas. Estos metales pesados pueden formar un complejo con los grupos funcionales de la cadena lateral presentes en una proteína o formar enlaces con tioles libres. Los metales pesados también desempeñan un papel en la oxidación de las cadenas laterales de aminoácidos presentes en las proteínas. Junto con esto, al interactuar con metaloproteínas, los metales pesados pueden dislocarse y reemplazar iones metálicos clave. Como resultado, los metales pesados pueden interferir con las proteínas plegadas, lo que puede afectar fuertemente la estabilidad y la actividad de las proteínas.

Reversibilidad e irreversibilidad

En muchos casos, la desnaturalización es reversible (las proteínas pueden recuperar su estado nativo cuando se elimina la influencia desnaturalizante). Este proceso puede llamarse renaturalización. Esta comprensión ha llevado a la noción de que toda la información necesaria para que las proteínas asuman su estado nativo estaba codificada en la estructura primaria de la proteína y, por lo tanto, en el ADN que codifica la proteína, el llamado "Anfinsen&# 39;hipótesis termodinámica".

La desnaturalización también puede ser irreversible. Esta irreversibilidad es típicamente una irreversibilidad cinética, no termodinámica, ya que una proteína plegada generalmente tiene menos energía libre que cuando está desplegada. A través de la irreversibilidad cinética, el hecho de que la proteína esté atrapada en un mínimo local puede evitar que se vuelva a plegar después de que se haya desnaturalizado de forma irreversible.

Desnaturalización de proteínas por pH

La desnaturalización también puede ser causada por cambios en el pH que pueden afectar la química de los aminoácidos y sus residuos. Los grupos ionizables de los aminoácidos pueden ionizarse cuando se producen cambios en el pH. Un cambio de pH a condiciones más ácidas o más básicas puede inducir el desdoblamiento. El desdoblamiento inducido por ácido a menudo ocurre entre pH 2 y 5, el desdoblamiento inducido por base generalmente requiere un pH de 10 o superior.

Desnaturalización de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos (incluidos el ARN y el ADN) son polímeros de nucleótidos sintetizados por las enzimas polimerasas durante la transcripción o la replicación del ADN. Después de 5'-3' En la síntesis de la columna vertebral, las bases nitrogenadas individuales son capaces de interactuar entre sí a través de enlaces de hidrógeno, lo que permite la formación de estructuras de orden superior. La desnaturalización del ácido nucleico se produce cuando se interrumpe el enlace de hidrógeno entre los nucleótidos y da como resultado la separación de cadenas previamente recocidas. Por ejemplo, la desnaturalización del ADN debido a las altas temperaturas da como resultado la ruptura de los pares de bases de Watson y Crick y la separación de la hélice de doble cadena en dos cadenas sencillas. Las hebras de ácido nucleico son capaces de volver a recocerse cuando se encuentran en condiciones "normales" las condiciones se restablecen, pero si la restauración ocurre demasiado rápido, las hebras de ácido nucleico pueden volver a hibridarse de manera imperfecta, lo que resulta en un emparejamiento inadecuado de bases.

Desnaturalización inducida biológicamente

La desnaturalización del ADN ocurre cuando los enlaces de hidrógeno entre Watson y Crick son perturbados.

Las interacciones no covalentes entre cadenas antiparalelas en el ADN se pueden romper para "abrir" la doble hélice cuando se establecen mecanismos biológicamente importantes como la replicación del ADN, la transcripción, la reparación del ADN o la unión a proteínas. El área de ADN parcialmente separado se conoce como burbuja de desnaturalización, que se puede definir más específicamente como la apertura de una doble hélice de ADN a través de la separación coordinada de pares de bases.

El primer modelo que intentó describir la termodinámica de la burbuja de desnaturalización se introdujo en 1966 y se denominó Modelo Polonia-Scheraga. Este modelo describe la desnaturalización de las cadenas de ADN en función de la temperatura. A medida que aumenta la temperatura, los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases de Watson y Crick se alteran cada vez más y se forman "bucles desnaturalizados" comenzar a formarse. Sin embargo, el modelo de Polonia-Scheraga ahora se considera elemental porque no tiene en cuenta las implicaciones de confusión de la secuencia de ADN, la composición química, la rigidez y la torsión.

Estudios termodinámicos recientes han inferido que la vida útil de una burbuja de desnaturalización singular oscila entre 1 microsegundo y 1 milisegundo. Esta información se basa en escalas de tiempo establecidas de replicación y transcripción del ADN. Actualmente, se están realizando estudios de investigación biofísica y bioquímica para dilucidar más completamente los detalles termodinámicos de la burbuja de desnaturalización.

Desnaturalización por agentes químicos

Formamide desnaturaliza el ADN al interrumpir los vínculos de hidrógeno entre Watson y los pares de base de Crick. Las líneas naranja, azul, verde y púrpura representan adenina, timina, guanina y citosina respectivamente. Las tres líneas negras cortas entre las bases y las moléculas formamida representan bonos de hidrógeno recién formados.

Dado que la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se encuentra entre los contextos más populares en los que se desea la desnaturalización del ADN, el calentamiento es el método de desnaturalización más frecuente. Además de la desnaturalización por calor, los ácidos nucleicos pueden sufrir el proceso de desnaturalización a través de varios agentes químicos como formamida, guanidina, salicilato de sodio, dimetilsulfóxido (DMSO), propilenglicol y urea. Estos agentes químicos desnaturalizantes reducen la temperatura de fusión (T_m) al competir por los donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno con pares de bases nitrogenadas preexistentes. Algunos agentes incluso pueden inducir la desnaturalización a temperatura ambiente. Por ejemplo, se ha demostrado que los agentes alcalinos (p. ej., NaOH) desnaturalizan el ADN cambiando el pH y eliminando los protones que contribuyen a los enlaces de hidrógeno. Estos desnaturalizantes se han empleado para hacer gel de electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), que promueve la desnaturalización de los ácidos nucleicos para eliminar la influencia de la forma del ácido nucleico en su movilidad electroforética.

Desnaturalización química como alternativa

La actividad óptica (absorción y dispersión de la luz) y las propiedades hidrodinámicas (difusión traslacional, coeficientes de sedimentación y tiempos de correlación rotacional) de los ácidos nucleicos desnaturalizados con formamida son similares a las de los ácidos nucleicos desnaturalizados por calor. Por lo tanto, dependiendo del efecto deseado, la desnaturalización química del ADN puede proporcionar un procedimiento más suave para desnaturalizar ácidos nucleicos que la desnaturalización inducida por calor. Los estudios que comparan diferentes métodos de desnaturalización, como calentamiento, molino de perlas de diferentes tamaños de perlas, sonicación con sonda y desnaturalización química, muestran que la desnaturalización química puede proporcionar una desnaturalización más rápida en comparación con los otros métodos de desnaturalización física descritos. Particularmente en los casos en los que se desea una renaturalización rápida, los agentes químicos de desnaturalización pueden proporcionar una alternativa ideal al calentamiento. Por ejemplo, las hebras de ADN desnaturalizadas con agentes alcalinos como NaOH se renaturalizan tan pronto como se agrega el tampón de fosfato.

Desnaturalización por aire

Las moléculas electronegativas pequeñas, como el nitrógeno y el oxígeno, que son los principales gases del aire, tienen un impacto significativo en la capacidad de las moléculas circundantes para participar en los enlaces de hidrógeno. Estas moléculas compiten con los aceptores de enlaces de hidrógeno circundantes por los donantes de enlaces de hidrógeno, por lo que actúan como "rompedores de enlaces de hidrógeno" y el debilitamiento de las interacciones entre las moléculas circundantes en el medio ambiente. Las hebras antiparalelas en las dobles hélices de ADN están unidas de forma no covalente por enlaces de hidrógeno entre los pares de bases de Watson y Crick; por lo tanto, el nitrógeno y el oxígeno mantienen el potencial de debilitar la integridad del ADN cuando se exponen al aire. Como resultado, las hebras de ADN expuestas al aire requieren menos fuerza para separarse y ejemplifican temperaturas de fusión más bajas.

Aplicaciones

Muchas técnicas de laboratorio se basan en la capacidad de separación de las cadenas de ácido nucleico. Al comprender las propiedades de la desnaturalización del ácido nucleico, se crearon los siguientes métodos:

• PCR
• Solar del sur
• Parcela norte
• ADN Secuencia

Desnaturalizantes

Desnaturalizantes de proteínas

Ácidos

Los desnaturalizantes de proteínas ácidas incluyen:

• Ácido acético
• Ácido tricloroacetico 12% en agua
• Ácido sulfosalico

Bases

Las bases funcionan de manera similar a los ácidos en la desnaturalización. Incluyen:

• Bicarbonato de sodio

Disolventes

La mayoría de los solventes orgánicos son desnaturalizantes, incluidos:

• Ethanol

Reactivos de entrecruzamiento

Los agentes de entrecruzamiento para proteínas incluyen:

• Formaldehyde
• Glutaraldehyde

Agentes caotrópicos

Los agentes caotrópicos incluyen:

• Urea 6-8 mol/L
• Cloruro de Guanidiio 6 mol/L
• Lithium perchlorate 4.5 mol/L
• Sodium dodecyl sulfate

Reductores de enlaces disulfuro

Los agentes que rompen los enlaces disulfuro por reducción incluyen:

• 2-Mercaptoethanol
• Dithiothreitol
• TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine)

Agentes químicamente reactivos

Agentes como el peróxido de hidrógeno, el cloro elemental, el ácido hipocloroso (agua con cloro), el bromo, el agua con bromo, el yodo, los ácidos nítrico y oxidante y el ozono reaccionan con fracciones sensibles como el sulfuro/tiol, los anillos aromáticos activados (fenilalanina) en dañan la proteína y la vuelven inútil.

Otro

• Agitación mecánica
• Ácido picante
• Radiación
• Temperatura

Desnaturalizantes de ácido nucleico

Químico

Los desnaturalizantes ácidos nucleicos incluyen:

• Ácido acético
• HCl
• Ácido nitrico

Los desnaturalizantes básicos de ácidos nucleicos incluyen:

• NaOH

Otros desnaturalizantes de ácidos nucleicos incluyen:

• DMSO
• Formamide
• Guanidine
• Salicilato de sodio
• Propylene glycol
• Urea

Físico

• Desnaturalización térmica
• Molino de cuentas
• Probe sonication
• Radiación