Degradación de edman

La degradación de Edman, desarrollada por Pehr Edman, es un método de secuenciación de aminoácidos en un péptido. En este método, el residuo amino terminal se marca y se escinde del péptido sin alterar los enlaces peptídicos entre otros residuos de aminoácidos.

mecanismo

El isotiocianato de fenilo se hace reaccionar con un grupo amino N-terminal sin carga, en condiciones ligeramente alcalinas, para formar un derivado de feniltiocarbamoilo cíclico. Luego, en condiciones ácidas, este derivado del aminoácido terminal se escinde como un derivado de tiazolinona. Luego, el aminoácido tiazolinona se extrae selectivamente en un disolvente orgánico y se trata con ácido para formar el derivado de aminoácido feniltiohidantoína (PTH), más estable, que puede identificarse mediante cromatografía o electroforesis. Luego, este procedimiento se puede repetir nuevamente para identificar el siguiente aminoácido. Un inconveniente importante de esta técnica es que los péptidos que se secuencian de esta manera no pueden tener más de 50 a 60 residuos (y en la práctica, menos de 30). La longitud del péptido está limitada debido a que la derivatización cíclica no siempre se completa. El problema de la derivatización se puede resolver escindiendo péptidos grandes en péptidos más pequeños antes de continuar con la reacción. Es capaz de secuenciar con precisión hasta 30 aminoácidos con máquinas modernas capaces de lograr una eficiencia superior al 99% por aminoácido. Una ventaja de la degradación de Edman es que sólo utiliza de 10 a 100 picomoles de péptido para el proceso de secuenciación. La reacción de degradación de Edman fue automatizada en 1967 por Edman y Beggs para acelerar el proceso y en 1973 se utilizaban 100 dispositivos automatizados en todo el mundo.

Limitaciones

Debido a que la degradación de Edman procede del extremo N de la proteína, no funcionará si el extremo N ha sido modificado químicamente (por ejemplo, mediante acetilación o formación de ácido piroglutámico). La secuenciación se detendrá si se encuentra un aminoácido que no sea α (por ejemplo, ácido isoaspártico), ya que el anillo intermedio de cinco miembros favorito no puede formarse. La degradación de Edman generalmente no es útil para determinar las posiciones de los puentes disulfuro. También requiere cantidades de péptidos de 1 picomol o más para obtener resultados discernibles.

Análisis acoplado

Después de la PÁGINA SDS 2D, las proteínas se pueden transferir a una membrana de transferencia de difluoruro de polivinilideno (PVDF) para su posterior análisis. Las degradaciones de Edman se pueden realizar directamente desde una membrana de PVDF. La secuenciación de residuos N-terminal que da como resultado de cinco a diez aminoácidos puede ser suficiente para identificar una proteína de interés (POI).