DAPI
DAPI (pronunciado 'DAPPY', /ˈdæpiː/), o 4′,6-diamidino-2-fenilindol, es un tinte fluorescente que se une fuertemente a regiones ricas en adenina y timina en el ADN. Se utiliza ampliamente en microscopía de fluorescencia. Como DAPI puede atravesar una membrana celular intacta, se puede utilizar para teñir células vivas y fijas, aunque atraviesa la membrana de manera menos eficiente en las células vivas y, por lo tanto, proporciona un marcador de la viabilidad de la membrana.
Historia
DAPI se sintetizó por primera vez en 1971 en el laboratorio de Otto Dann como parte de una búsqueda de fármacos para tratar la tripanosomiasis. Aunque no tuvo éxito como fármaco, investigaciones posteriores indicaron que se unía fuertemente al ADN y se volvía más fluorescente cuando se unía. Esto llevó a su uso para identificar el ADN mitocondrial en ultracentrifugación en 1975, el primer uso registrado de DAPI como tinción fluorescente de ADN.
La fuerte fluorescencia cuando se une al ADN condujo a la rápida adopción de DAPI para la tinción fluorescente del ADN para microscopía de fluorescencia. Su uso para detectar ADN en células vegetales, metazoos y bacterias y partículas de virus se demostró a finales de la década de 1970, y la tinción cuantitativa del ADN dentro de las células se demostró en 1977. El uso de DAPI como tinción de ADN para citometría de flujo también se demostró en esta época. .
Propiedades de fluorescencia
Cuando se une a ADN bicatenario, DAPI tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de 358 nm (ultravioleta) y su máximo de emisión es a 461 nm (azul). Por lo tanto, para la microscopía de fluorescencia, DAPI se excita con luz ultravioleta y se detecta a través de un filtro azul/cian. El pico de emisiones es bastante amplio. DAPI también se unirá al ARN, aunque no es tan fluorescente. Su emisión cambia a alrededor de 500 nm cuando se une al ARN.
La emisión azul de DAPI es conveniente para los microscopistas que desean utilizar múltiples tinciones fluorescentes en una sola muestra. Existe cierta superposición de fluorescencia entre DAPI y las moléculas fluorescentes verdes como la fluoresceína y la proteína fluorescente verde (GFP), pero el efecto de esto es pequeño. El uso de desmezcla espectral puede explicar este efecto si se requiere un análisis de imagen extremadamente preciso.
Además de la microscopía óptica de fluorescencia analítica, DAPI también es popular para el etiquetado de cultivos celulares para detectar el ADN de Mycoplasma o virus contaminantes. Las partículas de Mycoplasma o virus marcadas en el medio de crecimiento emiten fluorescencia una vez teñidas con DAPI, lo que las hace fáciles de detectar.
Modelado de propiedades de absorción y fluorescencia
Esta sonda fluorescente de ADN se ha modelado eficazmente utilizando la teoría funcional de la densidad dependiente del tiempo, junto con la versión IEF del modelo continuo polarizable. Este modelado mecánico-cuántico ha racionalizado el comportamiento de absorción y fluorescencia dado por la unión e intercalación de surcos menores en la bolsa de ADN, en términos de una flexibilidad estructural y una polarización reducidas.
Células vivas y toxicidad
DAPI se puede utilizar para la tinción de células fijas. La concentración de DAPI necesaria para la tinción de células vivas es generalmente muy alta; rara vez se utiliza para células vivas. Está etiquetado como no tóxico en su MSDS y, aunque no se demostró que tenga mutagenicidad para E. coli, está etiquetado como mutágeno conocido en la información del fabricante. Como es un pequeño compuesto que se une al ADN, es probable que tenga algunos efectos cancerígenos y se debe tener cuidado en su manipulación y eliminación.
Alternativas
Las tinciones de Hoechst son similares a DAPI en que también son tinciones de ADN azul fluorescente que son compatibles con aplicaciones de células vivas y fijas, además de ser visibles usando la misma configuración de filtro del equipo que para DAPI.