Cromatografía

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En análisis químico, la cromatografía es una técnica de laboratorio para la separación de una mezcla en sus componentes. La mezcla se disuelve en un solvente fluido (gas o líquido) llamado fase móvil, que la transporta a través de un sistema (una columna, un tubo capilar, un plato o una lámina) sobre el cual se encuentra un material llamado fase estacionaria.está arreglado. Debido a que los diferentes constituyentes de la mezcla tienden a tener diferentes afinidades por la fase estacionaria y son retenidos por diferentes periodos de tiempo dependiendo de sus interacciones con los sitios de la superficie, los constituyentes viajan a diferentes velocidades aparentes en el fluido móvil, causando que se separen. La separación se basa en la partición diferencial entre las fases móvil y estacionaria. Las diferencias sutiles en el coeficiente de partición de un compuesto dan como resultado una retención diferencial en la fase estacionaria y, por lo tanto, afectan la separación.

La cromatografía puede ser preparativa o analítica. El propósito de la cromatografía preparativa es separar los componentes de una mezcla para su uso posterior y, por lo tanto, es una forma de purificación. Este proceso está asociado a mayores costos debido a su modo de producción. La cromatografía analítica se realiza normalmente con cantidades más pequeñas de material y sirve para establecer la presencia o medir las proporciones relativas de analitos en una mezcla. Los dos tipos no son mutuamente excluyentes.

Etimología

La cromatografía, pronunciada, se deriva del griego χρῶμα chroma, que significa "color", y γράφειν graphein, que significa "escribir". La combinación de estos dos términos se heredó directamente de la invención de la primera técnica utilizada para separar pigmentos.

Historia

La cromatografía fue ideada por primera vez en Rusia por el científico nacido en Italia Mikhail Tsvet en 1900. Desarrolló la técnica y acuñó el término cromatografía en la primera década del siglo XX, principalmente para la separación de pigmentos vegetales como la clorofila, los carotenos y las xantofilas.. Dado que estos componentes se separan en bandas de diferentes colores (verde, naranja y amarillo, respectivamente) inspiraron directamente el nombre de la técnica. Los nuevos tipos de cromatografía desarrollados durante las décadas de 1930 y 1940 hicieron que la técnica fuera útil para muchos procesos de separación.

La técnica de cromatografía se desarrolló sustancialmente como resultado del trabajo de Archer John Porter Martin y Richard Laurence Millington Synge durante las décadas de 1940 y 1950, por lo que ganaron el Premio Nobel de Química en 1952.Establecieron los principios y las técnicas básicas de la cromatografía de partición y su trabajo fomentó el rápido desarrollo de varios métodos cromatográficos: cromatografía en papel, cromatografía de gases y lo que se conocería como cromatografía líquida de alta resolución. Desde entonces, la tecnología ha avanzado rápidamente. Los investigadores descubrieron que los principios fundamentales de la cromatografía de Tsvet se pueden aplicar de muchas maneras diferentes, lo que da como resultado las diferentes variedades de cromatografía que se describen a continuación. Los avances mejoran continuamente el rendimiento técnico de la cromatografía, lo que permite la separación de moléculas cada vez más similares.

Términos de cromatografía

La cromatografía se basa en el concepto de coeficiente de partición. Cualquier partición de soluto entre dos solventes inmiscibles. Cuando inmovilizamos un solvente (por adsorción en una matriz de soporte sólido) y otro móvil, se obtienen las aplicaciones más comunes de la cromatografía. Si el soporte de la matriz, o fase estacionaria, es polar (por ejemplo, papel, sílice, etc.) es cromatografía de fase directa, y si no es polar (C-18) es de fase inversa.

Técnicas por forma de lecho cromatográfico

Cromatografía de columna

Secuencia de cromatografía en columna.png

La cromatografía en columna es una técnica de separación en la que el lecho estacionario se encuentra dentro de un tubo. Las partículas de la fase estacionaria sólida o del soporte recubierto con una fase estacionaria líquida pueden llenar todo el volumen interior del tubo (columna empacada) o concentrarse sobre o a lo largo de la pared interior del tubo dejando un camino abierto y sin restricciones para la fase móvil en la parte media del tubo (columna tubular abierta). Las diferencias en las tasas de movimiento a través del medio se calculan para diferentes tiempos de retención de la muestra. En 1978, W. Clark Still introdujo una versión modificada de la cromatografía en columna denominada cromatografía en columna flash (flash).La técnica es muy similar a la cromatografía en columna tradicional, excepto que el solvente se conduce a través de la columna aplicando presión positiva. Esto permitió realizar la mayoría de las separaciones en menos de 20 minutos, con separaciones mejoradas en comparación con el método anterior. Los modernos sistemas de cromatografía flash se venden como cartuchos de plástico preempaquetados y el solvente se bombea a través del cartucho. Los sistemas también se pueden vincular con detectores y colectores de fracciones que brindan automatización. La introducción de bombas de gradiente resultó en separaciones más rápidas y menos uso de solventes.

En la adsorción de lecho expandido, se usa un lecho fluidizado, en lugar de una fase sólida hecha por un lecho empacado. Esto permite omitir los pasos iniciales de limpieza, como la centrifugación y la filtración, para caldos de cultivo o suspensiones de células rotas.

La cromatografía de fosfocelulosa utiliza la afinidad de unión de muchas proteínas de unión de ADN por la fosfocelulosa. Cuanto más fuerte sea la interacción de una proteína con el ADN, mayor será la concentración de sal necesaria para eluir esa proteína.

Cromatografía planar

La cromatografía planar es una técnica de separación en la que la fase estacionaria está presente como o en un plano. El plano puede ser un papel, sirviendo como tal o impregnado de una sustancia como el lecho estacionario (cromatografía en papel) o una capa de partículas sólidas esparcidas sobre un soporte como una placa de vidrio (cromatografía en capa fina). Diferentes compuestos en la mezcla de muestra viajan diferentes distancias según la fuerza con la que interactúan con la fase estacionaria en comparación con la fase móvil. El factor de retención específico (R f) de cada químico se puede usar para ayudar en la identificación de una sustancia desconocida.

Cromatografía en papel

La cromatografía en papel es una técnica que consiste en colocar un pequeño punto o línea de solución de muestra en una tira de papel de cromatografía. El papel se coloca en un recipiente con una capa poco profunda de disolvente y se sella. A medida que el solvente sube a través del papel, se encuentra con la mezcla de muestra, que comienza a subir por el papel con el solvente. Este papel está hecho de celulosa, una sustancia polar, y los compuestos dentro de la mezcla viajan más lejos si son menos polares. Las sustancias más polares se unen con el papel de celulosa más rápidamente y, por lo tanto, no viajan tan lejos.

Cromatografía en capa fina (TLC)

La cromatografía de capa fina (TLC) es una técnica de laboratorio ampliamente utilizada para separar diferentes bioquímicos en función de sus atracciones relativas a las fases estacionaria y móvil. Es similar a la cromatografía en papel. Sin embargo, en lugar de utilizar una fase estacionaria de papel, implica una fase estacionaria de una fina capa de adsorbente como gel de sílice, alúmina o celulosa sobre un sustrato plano e inerte. TLC es muy versátil; varias muestras se pueden separar simultáneamente en la misma capa, lo que lo hace muy útil para aplicaciones de detección como pruebas de niveles de drogas y pureza del agua.La posibilidad de contaminación cruzada es baja ya que cada separación se realiza en una nueva capa. Comparado con el papel, tiene la ventaja de corridas más rápidas, mejores separaciones, mejor análisis cuantitativo y la posibilidad de elegir entre diferentes adsorbentes. Para una resolución aún mejor y una separación más rápida que utiliza menos solvente, se puede usar TLC de alto rendimiento. Un uso popular más antiguo había sido diferenciar cromosomas observando la distancia en gel (la separación era un paso aparte).

Cromatografía de desplazamiento

El principio básico de la cromatografía de desplazamiento es: una molécula con una alta afinidad por la matriz de cromatografía (el desplazador) compite eficazmente por los sitios de unión y, por lo tanto, desplaza a todas las moléculas con menor afinidad. Existen claras diferencias entre la cromatografía de desplazamiento y la de elución. En el modo de elución, las sustancias suelen emerger de una columna en picos gaussianos estrechos. Se desea una amplia separación de picos, preferiblemente hasta la línea de base, para una máxima purificación. La velocidad a la que cualquier componente de una mezcla desciende por la columna en el modo de elución depende de muchos factores. Pero para que dos sustancias viajen a diferentes velocidades y, por lo tanto, se resuelvan, debe haber diferencias sustanciales en alguna interacción entre las biomoléculas y la matriz cromatográfica. Los parámetros operativos se ajustan para maximizar el efecto de esta diferencia. En muchos casos, la separación de la línea de base de los picos solo se puede lograr con elución en gradiente y cargas de columna bajas. Por lo tanto, dos inconvenientes de la cromatografía en modo de elución, especialmente a escala preparativa, son la complejidad operativa, debido al bombeo de solventes en gradiente, y el bajo rendimiento, debido a las bajas cargas de columna. La cromatografía de desplazamiento tiene ventajas sobre la cromatografía de elución en que los componentes se resuelven en zonas consecutivas de sustancias puras en lugar de "picos". Debido a que el proceso aprovecha la no linealidad de las isotermas, se puede separar una alimentación de columna más grande en una columna dada con los componentes purificados recuperados en concentraciones significativamente más altas.

Técnicas por estado físico de la fase móvil

Cromatografía de gases

La cromatografía de gases (GC), también conocida a veces como cromatografía gas-líquido (GLC), es una técnica de separación en la que la fase móvil es un gas. La separación por cromatografía de gases siempre se lleva a cabo en una columna, que suele ser "empaquetada" o "capilar". Las columnas empaquetadas son los caballos de trabajo de rutina de la cromatografía de gases, son más baratas y fáciles de usar y, a menudo, brindan un rendimiento adecuado. Las columnas capilares generalmente brindan una resolución muy superior y, aunque son más costosas, se están utilizando ampliamente, especialmente para mezclas complejas. Además, las columnas capilares se pueden dividir en tres clases: columnas tubulares abiertas de capa porosa (PLOT), columnas tubulares abiertas con revestimiento de pared (WCOT) y columnas tubulares abiertas con revestimiento de soporte (SCOT). Las columnas PLOT son únicas en el sentido de que la fase estacionaria se adsorbe en las paredes de la columna, mientras que las columnas WCOT tienen una fase estacionaria que se une químicamente a las paredes. Las columnas SCOT son, en cierto modo, la combinación de los dos tipos mencionados de manera que tienen partículas de soporte adheridas a las paredes de la columna, pero esas partículas tienen una fase líquida unida químicamente a ellas.Ambos tipos de columna están hechos de materiales no adsorbentes y químicamente inertes. El acero inoxidable y el vidrio son los materiales habituales para las columnas empaquetadas y el cuarzo o la sílice fundida para las columnas capilares.

La cromatografía de gases se basa en un equilibrio de partición del analito entre una fase estacionaria sólida o líquida viscosa (a menudo, un material líquido a base de silicona) y un gas móvil (la mayoría de las veces, helio). La fase estacionaria se adhiere al interior de un tubo de vidrio o de sílice fundida (una columna capilar) de diámetro pequeño (comúnmente de 0,53 a 0,18 mm de diámetro interior) o a una matriz sólida dentro de un tubo de metal más grande (una columna empaquetada). Es ampliamente utilizado en química analítica; aunque las altas temperaturas utilizadas en GC lo hacen inadecuado para biopolímeros o proteínas de alto peso molecular (el calor los desnaturaliza), que se encuentran con frecuencia en bioquímica, es muy adecuado para su uso en los campos petroquímico, de monitoreo y remediación ambiental y químico industrial. También se utiliza ampliamente en la investigación química.

Cromatografía líquida

La cromatografía líquida (LC) es una técnica de separación en la que la fase móvil es un líquido. Se puede realizar tanto en columna como en plano. La cromatografía líquida actual que generalmente utiliza partículas de relleno muy pequeñas y una presión relativamente alta se conoce como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

En HPLC, la muestra es forzada por un líquido a alta presión (la fase móvil) a través de una columna que está llena de una fase estacionaria compuesta de partículas de forma esférica o irregular, una capa monolítica porosa o una membrana porosa. Los monolitos son "medios cromatográficos en forma de esponja"y se componen de un bloque interminable de partes orgánicas o inorgánicas. Históricamente, HPLC se divide en dos subclases diferentes según la polaridad de las fases móvil y estacionaria. Los métodos en los que la fase estacionaria es más polar que la fase móvil (p. ej., tolueno como fase móvil, sílice como fase estacionaria) se denominan cromatografía líquida en fase normal (NPLC) y viceversa (p. ej., mezcla de agua y metanol como fase móvil). y C18 (octadecilsililo) como fase estacionaria) se denomina cromatografía líquida de fase inversa (RPLC).

Las técnicas específicas bajo este título general se enumeran a continuación.

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad se basa en la interacción selectiva no covalente entre un analito y moléculas específicas. Es muy específico, pero no muy robusto. A menudo se usa en bioquímica en la purificación de proteínas unidas a etiquetas. Estas proteínas de fusión están marcadas con compuestos como etiquetas His, biotina o antígenos, que se unen específicamente a la fase estacionaria. Después de la purificación, estas etiquetas generalmente se eliminan y se obtiene la proteína pura.

La cromatografía de afinidad a menudo utiliza la afinidad de una biomolécula por un metal (Zn, Cu, Fe, etc.). Las columnas a menudo se preparan manualmente. Las columnas de afinidad tradicionales se utilizan como paso preparatorio para eliminar las biomoléculas no deseadas.

Sin embargo, existen técnicas de cromatografía líquida que utilizan propiedades de cromatografía de afinidad. La cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) es útil para separar las moléculas antes mencionadas en función de la afinidad relativa por el metal. A menudo, estas columnas se pueden cargar con diferentes metales para crear una columna con una afinidad específica.

Cromatografía de fluidos supercríticos

La cromatografía de fluidos supercríticos es una técnica de separación en la que la fase móvil es un fluido por encima y relativamente cerca de su temperatura y presión críticas.

Técnicas por mecanismo de separación

Cromatografía de intercambio de iones

La cromatografía de intercambio iónico (generalmente conocida como cromatografía iónica) utiliza un mecanismo de intercambio iónico para separar los analitos en función de sus respectivas cargas. Suele realizarse en columnas pero también puede ser útil en modo planar. La cromatografía de intercambio iónico utiliza una fase estacionaria cargada para separar compuestos cargados, incluidos aniones, cationes, aminoácidos, péptidos y proteínas. En los métodos convencionales, la fase estacionaria es una resina de intercambio iónico que lleva grupos funcionales cargados que interactúan con grupos del compuesto con carga opuesta para retener. Hay dos tipos de cromatografía de intercambio iónico: intercambio catiónico e intercambio aniónico. En la Cromatografía de Intercambio Catiónico la fase estacionaria tiene carga negativa y el ión intercambiable es un catión, mientras que,La cromatografía de intercambio iónico se usa comúnmente para purificar proteínas usando FPLC.

Cromatografía de exclusión por tamaño

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) también se conoce como cromatografía de permeación en gel (GPC) o cromatografía de filtración en gel.y separa las moléculas según su tamaño (o más exactamente según su diámetro hidrodinámico o volumen hidrodinámico). Las moléculas más pequeñas pueden entrar en los poros del medio y, por lo tanto, quedan atrapadas y eliminadas del flujo de la fase móvil. El tiempo de residencia promedio en los poros depende del tamaño efectivo de las moléculas del analito. Sin embargo, las moléculas que son más grandes que el tamaño medio de los poros del relleno quedan excluidas y, por lo tanto, esencialmente no sufren retención; tales especies son las primeras en ser eluidas. Por lo general, es una técnica de cromatografía de baja resolución y, por lo tanto, a menudo se reserva para el paso final de "pulido" de una purificación. También es útil para determinar la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de proteínas purificadas,

Separación cromatográfica de adsorción en lecho expandido

Una columna de adsorción cromatográfica de lecho expandido (EBA) para un proceso de separación bioquímica comprende un distribuidor de líquido de compensación de presión que tiene una función de autolimpieza debajo de una placa de tamiz de bloqueo poroso en la parte inferior del lecho expandido, un conjunto de boquilla en la parte superior que tiene una función de limpieza de retrolavado en la parte superior del lecho expandido, una mejor distribución del licor de materia prima agregado al lecho expandido asegura que el fluido que pasa a través de la capa del lecho expandido muestra un estado de flujo de pistón. La capa de lecho expandido muestra un estado de flujo de pistón. La columna de separación cromatográfica de lecho expandido tiene la ventaja de aumentar la eficiencia de separación del lecho expandido.

La cromatografía de adsorción en lecho expandido (EBA) es una técnica conveniente y efectiva para la captura de proteínas directamente de una muestra cruda no clarificada. En la cromatografía EBA, el lecho sedimentado se expande primero mediante el flujo ascendente del tampón de equilibrio. La alimentación cruda, una mezcla de proteínas solubles, contaminantes, células y desechos celulares, se pasa luego hacia arriba a través del lecho expandido. Las proteínas objetivo se capturan en el adsorbente, mientras que las partículas y los contaminantes pasan. Un cambio al tampón de elución mientras se mantiene el flujo ascendente da como resultado la desorción de la proteína objetivo en el modo de lecho expandido. Alternativamente, si se invierte el flujo, las partículas adsorbidas se asentarán rápidamente y las proteínas pueden ser desorbidas por un tampón de elución. El modo utilizado para la elución (lecho expandido versus lecho sedimentado) depende de las características de la alimentación. Después de la elución,

Técnicas especiales

Cromatografía de fase inversa

La cromatografía de fase inversa (RPC) es cualquier procedimiento de cromatografía líquida en el que la fase móvil es significativamente más polar que la fase estacionaria. Se llama así porque en la cromatografía líquida de fase normal, la fase móvil es significativamente menos polar que la fase estacionaria. Las moléculas hidrofóbicas en la fase móvil tienden a adsorberse a la fase estacionaria relativamente hidrofóbica. Las moléculas hidrofílicas en la fase móvil tenderán a eluirse primero. Las columnas de separación normalmente comprenden una cadena de carbono C8 o C18 unida a un sustrato de partículas de sílice.

Cromatografía de interacción hidrofóbica

La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es una técnica analítica y de purificación que separa los analitos, como las proteínas, en función de las interacciones hidrofóbicas entre ese analito y la matriz cromatográfica. Puede proporcionar un enfoque ortogonal no desnaturalizante para la separación de fases inversas, conservando las estructuras nativas y potencialmente la actividad de las proteínas. En la cromatografía de interacción hidrofóbica, el material de la matriz está ligeramente sustituido con grupos hidrofóbicos. Estos grupos pueden oscilar entre grupos metilo, etilo, propilo, butilo, octilo o fenilo.A altas concentraciones de sal, las cadenas laterales no polares en la superficie de las proteínas "interactúan" con los grupos hidrofóbicos; es decir, ambos tipos de grupos son excluidos por el solvente polar (los efectos hidrófobos aumentan con el aumento de la fuerza iónica). Por lo tanto, la muestra se aplica a la columna en un tampón que es altamente polar, lo que genera una asociación de parches hidrofóbicos en el analito con la fase estacionaria. El eluyente suele ser un tampón acuoso con concentraciones decrecientes de sal, concentraciones crecientes de detergente (lo que interrumpe las interacciones hidrofóbicas) o cambios en el pH. De importancia crítica es el tipo de sal utilizada, con sales más cosmotrópicas según lo definido por la serie de Hofmeister proporcionando la mayor parte de la estructuración del agua alrededor de la molécula y la presión hidrofóbica resultante. El sulfato de amonio se usa frecuentemente para este propósito. La adición de disolventes orgánicos u otros constituyentes menos polares puede ayudar a mejorar la resolución.

En general, la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es ventajosa si la muestra es sensible al cambio de pH oa los solventes agresivos que normalmente se usan en otros tipos de cromatografía, pero no a las altas concentraciones de sal. Comúnmente, lo que varía es la cantidad de sal en el tampón. En 2012, Müller y Franzreb describieron los efectos de la temperatura en HIC utilizando albúmina de suero bovino (BSA) con cuatro tipos diferentes de resina hidrofóbica. El estudio alteró la temperatura para efectuar la afinidad de unión de BSA a la matriz. Se concluyó que el ciclo de temperatura de 50 a 10 grados no sería adecuado para lavar de manera efectiva todo el BSA de la matriz, pero podría ser muy efectivo si la columna se usara solo unas pocas veces. El uso de la temperatura para efectuar cambios permite a los laboratorios reducir costos en la compra de sal y ahorrar dinero.

Si desea evitar las altas concentraciones de sal junto con las fluctuaciones de temperatura, puede usar una más hidrofóbica para competir con su muestra para eluirla. [fuente] Este llamado método de HIC independiente de la sal mostró un aislamiento directo de la inmunoglobulina humana G (IgG) del suero con un rendimiento satisfactorio y usó beta-ciclodextrina como competidor para desplazar la IgG de la matriz. Esto abre en gran medida la posibilidad de usar HIC con muestras que son sensibles a la sal, ya que sabemos que las altas concentraciones de sal precipitan las proteínas.

Cromatografía hidrodinámica

La cromatografía hidrodinámica (HDC) se deriva del fenómeno observado de que las gotas grandes se mueven más rápido que las pequeñas. En una columna, esto sucede porque se evita que el centro de masa de las gotas más grandes esté tan cerca de los lados de la columna como las gotas más pequeñas debido a su mayor tamaño total. Las gotas más grandes eluyen primero desde el centro de la columna, mientras que las gotas más pequeñas se adhieren a los lados de la columna y eluyen en último lugar. Esta forma de cromatografía es útil para separar analitos por masa molar, tamaño, forma y estructura cuando se usa junto con detectores de dispersión de luz, viscosímetros y refractómetros.Los dos tipos principales de HDC son de tubo abierto y de columna empacada. El tubo abierto ofrece tiempos de separación rápidos para partículas pequeñas, mientras que la HDC de columna empacada puede aumentar la resolución y es más adecuada para partículas con una masa molecular promedio mayor que{ estilo de visualización 10^{5}}10^{5}daltons. La HDC se diferencia de otros tipos de cromatografía porque la separación solo tiene lugar en el volumen intersticial, que es el volumen que rodea y se encuentra entre las partículas de una columna de relleno.

HDC comparte el mismo orden de elución que la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), pero los dos procesos aún varían en muchos aspectos. En un estudio que compara los dos tipos de separación, Isenberg, Brewer, Côté y Striegel usan ambos métodos para la caracterización de polisacáridos y concluyen que HDC junto con dispersión de luz multiángulo (MALS) logra una distribución de masa molar más precisa en comparación con MALS fuera de línea que SEC en mucho menos tiempo. Esto se debe en gran medida a que la SEC es una técnica más destructiva debido a que los poros de la columna degradan el analito durante la separación, lo que tiende a afectar la distribución de masa.Sin embargo, la principal desventaja de la HDC es la baja resolución de los picos de los analitos, lo que hace que la SEC sea una opción más viable cuando se utiliza con productos químicos que no se degradan fácilmente y donde la elución rápida no es importante.

HDC juega un papel especialmente importante en el campo de la microfluídica. El primer aparato exitoso para el sistema HDC-on-a-chip fue propuesto por Chmela, et al. en 2002. Su diseño pudo lograr separaciones utilizando un canal de 80 mm de largo en una escala de tiempo de 3 minutos para partículas con diámetros que oscilan entre 26 y 110 nm, pero los autores expresaron la necesidad de mejorar los parámetros de retención y dispersión. En una publicación de 2010 de Jellema, Markesteijn, Westerweel y Verpoorte, la implementación de HDC con un flujo bidireccional recirculante dio como resultado una separación basada en el tamaño de alta resolución con un canal de solo 3 mm de largo. Tener un canal tan corto y una resolución tan alta se consideró especialmente impresionante teniendo en cuenta que los estudios anteriores utilizaron canales de 80 mm de longitud.Para una aplicación biológica, en 2007, Huh, et al. propuso un dispositivo de clasificación de microfluidos basado en HDC y gravedad, que fue útil para evitar que partículas potencialmente peligrosas con un diámetro superior a 6 micrones ingresen al torrente sanguíneo al inyectar agentes de contraste en ultrasonidos. Este estudio también logró avances para la sustentabilidad ambiental en microfluidos debido a la falta de componentes electrónicos externos que impulsen el flujo, lo que resultó ser una ventaja de usar un dispositivo basado en la gravedad.

Cromatografía bidimensional

En algunos casos, la selectividad proporcionada por el uso de una columna puede ser insuficiente para brindar resolución de analitos en muestras complejas. La cromatografía bidimensional tiene como objetivo aumentar la resolución de estos picos mediante el uso de una segunda columna con diferentes propiedades fisicoquímicas (clasificación química). Dado que el mecanismo de retención en este nuevo soporte sólido es diferente de la primera separación dimensional, es posible separar compuestos por cromatografía bidimensional que son indistinguibles por cromatografía unidimensional. Además, la separación en la segunda dimensión ocurre más rápido que en la primera dimensión.Un ejemplo de una separación por TLC bidimensional es cuando la muestra se coloca en una esquina de una placa cuadrada, se revela, se seca al aire, luego se gira 90° y, por lo general, se vuelve a revelar en un segundo sistema de solventes. La cromatografía bidimensional se puede aplicar a las separaciones de GC o LC. Este método de separación también se puede utilizar en un enfoque desgarrador, en el que se seleccionan regiones de interés específicas en la primera dimensión para separarlas en la segunda dimensión, o en un enfoque integral, en el que todos los analitos de la primera dimensión se someten a la segunda dimensión. separación.

Cromatografía de lecho móvil simulado

La técnica de lecho móvil simulado (SMB) es una variante de la cromatografía líquida de alta resolución; se utiliza para separar partículas y/o compuestos químicos que de otro modo serían difíciles o imposibles de resolver. Esta mayor separación se logra mediante un arreglo de válvula y columna que se usa para alargar la fase estacionaria indefinidamente. En la técnica de lecho móvil de la cromatografía preparativa, la entrada de alimentación y la recuperación del analito son simultáneas y continuas, pero debido a las dificultades prácticas con un lecho móvil continuo, se propuso la técnica de lecho móvil simulado. En la técnica de lecho móvil simulado, en lugar de mover el lecho, las posiciones de entrada de la muestra y salida del analito se mueven continuamente, dando la impresión de un lecho móvil. La verdadera cromatografía de lecho móvil (TMBC) es solo un concepto teórico. Su simulación,

Cromatografía de gases de pirólisis

La pirólisis-cromatografía de gases-espectrometría de masas es un método de análisis químico en el que la muestra se calienta hasta la descomposición para producir moléculas más pequeñas que se separan mediante cromatografía de gases y se detectan mediante espectrometría de masas.

La pirólisis es la descomposición térmica de materiales en una atmósfera inerte o al vacío. La muestra se pone en contacto directo con un alambre de platino o se coloca en un tubo de muestra de cuarzo y se calienta rápidamente a 600–1000 °C. Dependiendo de la aplicación, se utilizan temperaturas aún más altas. En los pirolizadores reales se utilizan tres técnicas de calentamiento diferentes: horno isotérmico, calentamiento inductivo (filamento de punto Curie) y calentamiento resistivo con filamentos de platino. Las moléculas grandes se escinden en sus puntos más débiles y producen fragmentos más pequeños y volátiles. Estos fragmentos se pueden separar por cromatografía de gases. Los cromatogramas GC de pirólisis suelen ser complejos porque se forma una amplia gama de diferentes productos de descomposición. Los datos pueden usarse como huellas dactilares para probar la identidad del material o los datos de GC/MS se usan para identificar fragmentos individuales para obtener información estructural. Para aumentar la volatilidad de los fragmentos polares, se pueden agregar varios reactivos de metilación a una muestra antes de la pirólisis.

Además del uso de pirolizadores dedicados, la GC de pirólisis de muestras sólidas y líquidas se puede realizar directamente dentro de los inyectores del vaporizador de temperatura programable (PTV) que proporcionan un calentamiento rápido (hasta 30 °C/s) y altas temperaturas máximas de 600–650 °C. Esto es suficiente para algunas aplicaciones de pirólisis. La principal ventaja es que no es necesario comprar un instrumento específico y la pirólisis se puede realizar como parte del análisis GC de rutina. En este caso, se deben utilizar revestimientos de entrada de GC de cuarzo. Se pueden adquirir datos cuantitativos y también se publican buenos resultados de derivatización dentro del inyector PTV.

Cromatografía líquida rápida de proteínas

La cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) es una forma de cromatografía líquida que se usa a menudo para analizar o purificar mezclas de proteínas. Como en otras formas de cromatografía, la separación es posible porque los diferentes componentes de una mezcla tienen diferentes afinidades por dos materiales, un fluido en movimiento (la "fase móvil") y un sólido poroso (la fase estacionaria). En FPLC, la fase móvil es una solución acuosa o "tampón". La tasa de flujo del amortiguador está controlada por una bomba de desplazamiento positivo y normalmente se mantiene constante, mientras que la composición del amortiguador puede variar extrayendo fluidos en diferentes proporciones de dos o más depósitos externos. La fase estacionaria es una resina compuesta de perlas, generalmente de agarosa reticulada, empaquetadas en una columna cilíndrica de vidrio o plástico.

Cromatografía a contracorriente

La cromatografía de contracorriente (CCC) es un tipo de cromatografía líquido-líquido, donde tanto la fase estacionaria como la móvil son líquidas y la fase estacionaria líquida se mantiene estancada por una fuerte fuerza centrífuga.

Cromatografía de contracorriente hidrodinámica (CCC)

El principio de funcionamiento del instrumento CCC requiere una columna que consta de un tubo abierto enrollado alrededor de una bobina. La bobina gira en un movimiento giratorio de doble eje (cardioide), lo que hace que un campo de gravedad variable (G) actúe sobre la columna durante cada rotación. Este movimiento hace que la columna vea un paso de partición por revolución y los componentes de la muestra se separan en la columna debido a su coeficiente de partición entre las dos fases líquidas inmiscibles utilizadas. Hay muchos tipos de CCC disponibles en la actualidad. Estos incluyen HSCCC (CCC de alta velocidad) y HPCCC (CCC de alto rendimiento). HPCCC es la versión más reciente y de mejor rendimiento de la instrumentación disponible actualmente.

Cromatografía de partición centrífuga (CPC)

En el instrumento CPC (cromatografía de partición centrífuga o cromatografía de contracorriente hidrostática), la columna consta de una serie de celdas interconectadas por conductos unidos a un rotor. Este rotor gira sobre su eje central creando el campo centrífugo necesario para mantener la fase estacionaria en su lugar. El proceso de separación en CPC se rige únicamente por la partición de solutos entre las fases estacionaria y móvil, cuyo mecanismo se puede describir fácilmente usando los coeficientes de partición (KD ) de solutos. Los instrumentos CPC están disponibles comercialmente para separaciones a escala industrial, piloto y de laboratorio con diferentes tamaños de columnas que van desde unos 10 mililitros hasta 10 litros de volumen.

Cromatografía periódica a contracorriente

A diferencia de la cromatografía en contracorriente (ver arriba), la cromatografía en contracorriente periódica (PCC) utiliza una fase estacionaria sólida y solo una fase móvil líquida. Por tanto, es mucho más similar a la cromatografía de afinidad convencional que a la cromatografía de contracorriente. PCC utiliza varias columnas, que durante la fase de carga se conectan en línea. Este modo permite sobrecargar la primera columna de esta serie sin perder producto, que ya atraviesa la columna antes de que la resina esté completamente saturada. El producto de avance se captura en la(s) columna(s) subsiguiente(s). En un paso siguiente, las columnas se desconectan entre sí. La primera columna se lava y eluye, mientras que las otras columnas aún se cargan. Una vez que la primera columna (inicialmente) se vuelve a equilibrar, se vuelve a introducir en el flujo de carga, pero como última columna.

Cromatografía quiral

La cromatografía quiral implica la separación de estereoisómeros. En el caso de los enantiómeros, estos no tienen diferencias químicas o físicas además de ser imágenes especulares tridimensionales. La cromatografía convencional u otros procesos de separación son incapaces de separarlos. Para permitir que se produzcan las separaciones quirales, la fase móvil o la fase estacionaria deben hacerse quirales, dando diferentes afinidades entre los analitos. Las columnas HPLC de cromatografía quiral (con una fase estacionaria quiral) en fase normal e inversa están disponibles comercialmente.

Cromatografía acuosa de fase normal

La cromatografía en fase normal acuosa (ANP) se caracteriza por el comportamiento de elución del modo de fase normal clásico (es decir, donde la fase móvil es significativamente menos polar que la fase estacionaria) en la que el agua es uno de los componentes del sistema solvente de la fase móvil. Se distingue de la cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) en que el mecanismo de retención se debe a la adsorción en lugar de la partición.

Aplicaciones

La cromatografía se utiliza en muchos campos, incluida la industria farmacéutica, la industria de alimentos y bebidas, la industria química, la ciencia forense, el análisis ambiental y los hospitales.