Cromatografía de exclusión por tamaño

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), también conocida como cromatografía de tamiz molecular, es un método cromatográfico en el que se separan moléculas en solución por su tamaño y, en algunos casos, por su peso molecular. Suele aplicarse a moléculas grandes o complejos macromoleculares como proteínas y polímeros industriales. Por lo general, cuando se usa una solución acuosa para transportar la muestra a través de la columna, la técnica se conoce como cromatografía de filtración en gel, frente al nombre de cromatografía de permeación en gel, que se usa cuando se usa un solvente orgánico como una fase móvil. La columna de cromatografía está llena de perlas finas y porosas que normalmente están compuestas de polímeros de dextrano, agarosa o poliacrilamida. Los tamaños de poro de estas perlas se utilizan para estimar las dimensiones de las macromoléculas. SEC es un método de caracterización de polímeros ampliamente utilizado debido a su capacidad para proporcionar buenos resultados de distribución de masa molar (Mw) para polímeros.

Aplicaciones

La principal aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaño es el fraccionamiento de proteínas y otros polímeros solubles en agua, mientras que la cromatografía de permeación en gel se utiliza para analizar la distribución del peso molecular de los polímeros orgánicos solubles. Ninguna de las dos técnicas debe confundirse con la electroforesis en gel, en la que se usa un campo eléctrico para "jalar" moléculas a través del gel dependiendo de sus cargas eléctricas. La cantidad de tiempo que un soluto permanece dentro de un poro depende del tamaño del poro. Los solutos más grandes tendrán acceso a un volumen más pequeño y viceversa. Por lo tanto, un soluto más pequeño permanecerá dentro del poro durante un período de tiempo más largo en comparación con un soluto más grande.

Otro uso de la cromatografía de exclusión por tamaño es examinar la estabilidad y las características de la materia orgánica natural en el agua. En este método, Margit B. Muller, Daniel Schmitt y Fritz H. Frimmel probaron fuentes de agua de diferentes lugares del mundo para determinar qué tan estable es la materia orgánica natural durante un período de tiempo. Aunque la cromatografía de exclusión por tamaño se utiliza ampliamente para estudiar material orgánico natural, existen limitaciones. Una de estas limitaciones incluye que no existe un marcador de peso molecular estándar; por lo tanto, no hay nada con lo que comparar los resultados. Si se requiere un peso molecular preciso, se deben usar otros métodos.

Ventajas

Las ventajas de este método incluyen una buena separación de las moléculas grandes de las moléculas pequeñas con un volumen mínimo de eluato, y que se pueden aplicar varias soluciones sin interferir con el proceso de filtración, todo mientras se preserva la actividad biológica de las partículas para separar. La técnica generalmente se combina con otras que separan aún más las moléculas por otras características, como la acidez, la basicidad, la carga y la afinidad por ciertos compuestos. Con la cromatografía de exclusión por tamaño, existen tiempos de separación cortos y bien definidos y bandas estrechas, lo que conduce a una buena sensibilidad. Tampoco hay pérdida de muestra porque los solutos no interactúan con la fase estacionaria.

La otra ventaja a este método experimental es que en ciertos casos es factible determinar el peso molecular aproximado de un compuesto. La forma y el tamaño del compuesto (eluente) determinan cómo el compuesto interactúa con el gel (fase estecionaria). Para determinar el peso molecular aproximado, se obtienen los volúmenes de elución de compuestos con sus pesos moleculares correspondientes y luego una parcela de “K_av” vs “log(Mw)” se hace, donde ${displaystyle K_{av}=(V_{e}-V_{o}/(V_{t}-V_{o})}$y Mw es la masa molecular. Esta parcela actúa como curva de calibración, que se utiliza para aproximar el peso molecular del compuesto deseado. La V_e componente representa el volumen en el que las moléculas intermedias elute tales como moléculas que tienen acceso parcial a las cuentas de la columna. Además, V_t es la suma del volumen total entre las cuentas y el volumen dentro de las cuentas. La V_o componente representa el volumen en el que las moléculas más grandes elute, que elute en el principio. Las desventajas son, por ejemplo, que sólo un número limitado de bandas se pueden acomodar porque la escala de tiempo del cromatograma es corta, y, en general, debe haber una diferencia del 10% en masa molecular para tener una buena resolución.

Descubrimiento

La técnica fue inventada en 1955 por Grant Henry Lathe y Colin R Ruthven, que trabajaban en el Queen Charlotte's Hospital de Londres. Posteriormente recibieron el premio John Scott por este invento. Mientras que Lathe y Ruthven usaron geles de almidón como matriz, Jerker Porath y Per Flodin introdujeron más tarde geles de dextrano; otros geles con propiedades de fraccionamiento por tamaño incluyen agarosa y poliacrilamida. Ha aparecido una breve reseña de estos desarrollos.

También hubo intentos de fraccionar altos polímeros sintéticos; sin embargo, no fue hasta 1964, cuando J. C. Moore de la Dow Chemical Company publicó su trabajo sobre la preparación de columnas de cromatografía de permeación en gel (GPC) a base de poliestireno reticulado con tamaño de poro controlado, que se produjo un rápido aumento de la actividad investigadora en este comenzó el campo. Se reconoció casi de inmediato que con la calibración adecuada, GPC era capaz de proporcionar información sobre la masa molar y la distribución de masa molar para polímeros sintéticos. Debido a que la última información era difícil de obtener por otros métodos, la GPC se empezó a usar rápidamente.

Teoría y método

Columnas SEC basadas en agarosa utilizadas para la purificación de proteínas en una máquina AKTA FPLC

SEC se utiliza principalmente para el análisis de moléculas grandes como proteínas o polímeros. SEC funciona atrapando moléculas más pequeñas en los poros del adsorbente ("fase estacionaria"). Este proceso generalmente se realiza dentro de una columna, que generalmente consta de un tubo hueco empaquetado herméticamente con perlas de polímero a escala micrométrica que contienen poros de diferentes tamaños. Estos poros pueden ser depresiones en la superficie o canales a través de la perla. A medida que la solución desciende por la columna, algunas partículas entran en los poros. Las partículas más grandes no pueden entrar en tantos poros. Cuanto más grandes son las partículas, más rápida es la elución. Las moléculas más grandes simplemente pasan por los poros porque esas moléculas son demasiado grandes para entrar en los poros. Por lo tanto, las moléculas más grandes fluyen a través de la columna más rápidamente que las moléculas más pequeñas, es decir, cuanto más pequeña es la molécula, mayor es el tiempo de retención.

Un requisito para la SEC es que el analito no interactúe con la superficie de las fases estacionarias, y las diferencias en el tiempo de elución entre los analitos se basan idealmente únicamente en el volumen de soluto que los analitos pueden ingresar, en lugar de interacciones químicas o electrostáticas con el fases estacionarias. Por lo tanto, una molécula pequeña que puede penetrar cada región del sistema de poros de la fase estacionaria puede ingresar en un volumen total igual a la suma del volumen de poro total y el volumen entre partículas. Esta pequeña molécula eluye tarde (después de que la molécula haya penetrado todo el volumen de poros e interpartículas, aproximadamente el 80 % del volumen de la columna). En el otro extremo, una molécula muy grande que no puede penetrar en los poros más pequeños puede entrar solo en el volumen entre partículas (~35 % del volumen de la columna) y eluye antes cuando este volumen de fase móvil ha pasado a través de la columna. El principio subyacente de SEC es que las partículas de diferentes tamaños eluyen (filtran) a través de una fase estacionaria a diferentes velocidades. Esto da como resultado la separación de una solución de partículas en función del tamaño. Siempre que todas las partículas se carguen simultáneamente o casi simultáneamente, las partículas del mismo tamaño deben eluirse juntas.

Sin embargo, como existen varias medidas del tamaño de una macromolécula (por ejemplo, el radio de giro y el radio hidrodinámico), un problema fundamental en la teoría de la SEC ha sido la elección de un parámetro de tamaño molecular adecuado mediante el cual se separan moléculas de diferentes tipos. Experimentalmente, Benoit y sus colaboradores encontraron una excelente correlación entre el volumen de elución y un tamaño molecular de base dinámica, el volumen hidrodinámico, para varias arquitecturas de cadena y composiciones químicas diferentes. La correlación observada basada en el volumen hidrodinámico se aceptó como la base de la calibración universal SEC.

Aún así, el uso del volumen hidrodinámico, un tamaño basado en las propiedades dinámicas, en la interpretación de los datos SEC no se comprende completamente. Esto se debe a que la SEC generalmente se ejecuta en condiciones de caudal bajo, donde el factor hidrodinámico debería tener poco efecto en la separación. De hecho, tanto la teoría como las simulaciones por computadora asumen un principio de separación termodinámica: el proceso de separación está determinado por la distribución de equilibrio (partición) de macromoléculas de soluto entre dos fases: una fase de solución a granel diluida ubicada en el espacio intersticial y fases de solución confinada dentro de los poros. de material de relleno de la columna. Basándose en esta teoría, se ha demostrado que el parámetro de tamaño relevante para la partición de polímeros en los poros es la dimensión media del tramo (proyección media máxima sobre una línea). Aunque este problema no se ha resuelto por completo, es probable que la dimensión media del claro y el volumen hidrodinámico estén fuertemente correlacionados.

Una columna de exclusión de tamaño

Cada columna de exclusión por tamaño tiene un rango de pesos moleculares que se pueden separar. El límite de exclusión define el peso molecular en el extremo superior de la columna 'trabajo' rango y es donde las moléculas son demasiado grandes para quedar atrapadas en la fase estacionaria. El extremo inferior del rango está definido por el límite de permeación, que define el peso molecular de una molécula que es lo suficientemente pequeña para penetrar todos los poros de la fase estacionaria. Todas las moléculas por debajo de esta masa molecular son tan pequeñas que eluyen como una sola banda.

La solución filtrada que se recoge al final se conoce como eluido. El volumen vacío incluye cualquier partícula demasiado grande para entrar en el medio, y el volumen de disolvente se conoce como volumen de columna.

Los siguientes son los materiales que se usan comúnmente para perlas de gel poroso en cromatografía de exclusión por tamaño

Factores que afectan la filtración

Un dibujo ilustrando la teoría detrás cromatografía de exclusión de tamaño

En situaciones de la vida real, las partículas en solución no tienen un tamaño fijo, lo que da como resultado la probabilidad de que una partícula que de otro modo se vería obstaculizada por un poro pase justo a su lado. Además, las partículas de fase estacionaria no están idealmente definidas; tanto las partículas como los poros pueden variar en tamaño. Las curvas de elución, por lo tanto, se parecen a las distribuciones gaussianas. La fase estacionaria también puede interactuar de formas no deseadas con una partícula e influir en los tiempos de retención, aunque los fabricantes de columnas tienen mucho cuidado en utilizar fases estacionarias que sean inertes y minimizar este problema.

Al igual que otras formas de cromatografía, aumentar la longitud de la columna mejora la resolución y aumentar el diámetro de la columna aumenta la capacidad de la columna. El empaquetamiento adecuado de la columna es importante para obtener la máxima resolución: una columna sobreempaquetada puede colapsar los poros de las perlas, lo que resulta en una pérdida de resolución. Una columna poco empaquetada puede reducir el área de superficie relativa de la fase estacionaria accesible a las especies más pequeñas, lo que hace que esas especies pasen menos tiempo atrapadas en los poros. A diferencia de las técnicas de cromatografía de afinidad, una cabeza de solvente en la parte superior de la columna puede disminuir drásticamente la resolución a medida que la muestra se difunde antes de la carga, lo que amplía la elución aguas abajo.

Análisis

En columnas manuales simples, el eluyente se recolecta en volúmenes constantes, conocidos como fracciones. Cuanto más similares sean las partículas en tamaño, más probable es que estén en la misma fracción y no se detecten por separado. Las columnas más avanzadas superan este problema monitoreando constantemente el eluyente.

Normalización de una columna de exclusión de tamaño

Las fracciones recolectadas a menudo se examinan mediante técnicas espectroscópicas para determinar la concentración de las partículas eluidas. Las técnicas comunes de detección por espectroscopia son el índice de refracción (RI) y el ultravioleta (UV). Al eluir especies espectroscópicamente similares (como durante la purificación biológica), pueden ser necesarias otras técnicas para identificar el contenido de cada fracción. También es posible analizar el flujo de eluyente de forma continua con mediciones de RI, LALLS, dispersión de luz láser multiángulo MALS, UV y/o viscosidad.

cromatograma SEC de una muestra biológica

El volumen de elución (Ve) disminuye aproximadamente de forma lineal con el logaritmo del volumen hidrodinámico molecular. Las columnas a menudo se calibran con 4 o 5 muestras estándar (p. ej., proteínas plegadas de peso molecular conocido) y una muestra que contiene una molécula muy grande, como la tiroglobulina, para determinar el volumen vacío. (El dextrano azul no se recomienda para la determinación de Vo porque es heterogéneo y puede dar resultados variables) Los volúmenes de elución de los estándares se dividen por el volumen de elución de la tiroglobulina (Ve/Vo) y se representan frente al logaritmo de los estándares' pesos moleculares

Aplicaciones

Aplicaciones bioquímicas

En general, la SEC se considera una cromatografía de baja resolución, ya que no distingue muy bien especies similares y, por lo tanto, a menudo se reserva para el paso final de una purificación. La técnica puede determinar la estructura cuaternaria de proteínas purificadas que tienen tiempos de intercambio lentos, ya que puede realizarse en condiciones de solución nativa, preservando las interacciones macromoleculares. SEC también puede analizar la estructura terciaria de la proteína, ya que mide el volumen hidrodinámico (no el peso molecular), lo que permite distinguir las versiones plegadas y desplegadas de la misma proteína. Por ejemplo, el radio hidrodinámico aparente de un dominio proteico típico puede ser de 14 Å y 36 Å para las formas plegadas y desplegadas, respectivamente. SEC permite la separación de estas dos formas, ya que la forma plegada eluye mucho más tarde debido a su menor tamaño.

Síntesis de polímeros

SEC se puede utilizar como una medida tanto del tamaño como de la polidispersidad de un polímero sintetizado, es decir, la capacidad de encontrar la distribución de los tamaños de las moléculas de polímero. Si se ejecutan previamente estándares de un tamaño conocido, se puede crear una curva de calibración para determinar los tamaños de las moléculas de polímero de interés en el solvente elegido para el análisis (a menudo THF). De manera alternativa, se pueden usar en línea técnicas como la dispersión de luz y/o la viscosimetría con SEC para producir pesos moleculares absolutos que no dependen de la calibración con estándares de peso molecular conocido. Debido a la diferencia de tamaño de dos polímeros con pesos moleculares idénticos, los métodos de determinación absoluta son, en general, más deseables. Un sistema SEC típico puede proporcionar rápidamente (en aproximadamente media hora) a los químicos de polímeros información sobre el tamaño y la polidispersidad de la muestra. El SEC preparativo se puede utilizar para el fraccionamiento de polímeros a escala analítica.

Inconvenientes

En SEC, la masa no se mide tanto como el volumen hidrodinámico de las moléculas de polímero, es decir, cuánto espacio ocupa una molécula de polímero en particular cuando está en solución. Sin embargo, el peso molecular aproximado se puede calcular a partir de los datos SEC porque se puede encontrar la relación exacta entre el peso molecular y el volumen hidrodinámico del poliestireno. Para esto, el poliestireno se usa como estándar. Pero la relación entre el volumen hidrodinámico y el peso molecular no es la misma para todos los polímeros, por lo que solo se puede obtener una medida aproximada. Otro inconveniente es la posibilidad de interacción entre la fase estacionaria y el analito. Cualquier interacción conduce a un tiempo de elución posterior y, por lo tanto, imita un tamaño de analito más pequeño.

Al realizar este método, las bandas de las moléculas eluidas pueden ensancharse. Esto puede ocurrir por la turbulencia provocada por el flujo de las moléculas de la fase móvil que pasan a través de las moléculas de la fase estacionaria. Además, la difusión térmica molecular y la fricción entre las moléculas de las paredes de vidrio y las moléculas del eluyente contribuyen al ensanchamiento de las bandas. Además de ensancharse, las bandas también se superponen entre sí. Como resultado, el eluyente suele diluirse considerablemente. Se pueden tomar algunas precauciones para evitar la probabilidad de que las bandas se ensanchen. Por ejemplo, se puede aplicar la muestra en una banda estrecha y muy concentrada en la parte superior de la columna. Cuanto más concentrado esté el eluyente, más eficaz será el procedimiento. Sin embargo, no siempre es posible concentrar el eluyente, lo que puede considerarse como una desventaja más.

Cromatografía absoluta de exclusión por tamaño

La cromatografía de exclusión por tamaño absoluto (ASEC) es una técnica que combina un instrumento de dispersión de luz, más comúnmente dispersión de luz multiángulo (MALS) u otra forma de dispersión de luz estática (SLS), pero posiblemente una dispersión de luz dinámica (DLS), a un sistema de cromatografía de exclusión por tamaño para mediciones de tamaño y/o masa molar absoluta de proteínas y macromoléculas a medida que eluyen del sistema de cromatografía.

La definición de "absoluto" en este caso es que no se requiere la calibración del tiempo de retención en la columna con un conjunto de estándares de referencia para obtener la masa molar o el tamaño hidrodinámico, a menudo denominado diámetro hidrodinámico (D _H en unidades de nm). Las interacciones de columna no ideales, como las interacciones superficiales electrostáticas o hidrofóbicas que modulan el tiempo de retención en relación con los estándares, no afectan el resultado final. Asimismo, las diferencias entre la conformación del analito y el estándar no tienen efecto en una medición absoluta; por ejemplo, con el análisis MALS, la masa molar de las proteínas inherentemente desordenadas se caracteriza con precisión a pesar de que eluyen mucho antes que las proteínas globulares con la misma masa molar, y lo mismo ocurre con los polímeros ramificados que eluyen tarde en comparación con los estándares de referencia lineales. con la misma masa molar. Otro beneficio de ASEC es que la masa molar y/o el tamaño se determina en cada punto de un pico de elución y, por lo tanto, indica homogeneidad o polidispersidad dentro del pico. Por ejemplo, el análisis SEC-MALS de una proteína monodispersa mostrará que todo el pico consta de moléculas con la misma masa molar, algo que no es posible con el análisis SEC estándar.

La determinación de la masa molar con SLS requiere combinar las medidas de dispersión de luz con las medidas de concentración. Por lo tanto, SEC-MALS generalmente incluye el detector de dispersión de luz y un refractómetro diferencial o un detector de absorbancia UV/Vis. Además, MALS determina el radio rms R_g de las moléculas por encima de un límite de tamaño determinado, normalmente 10 nm. Por lo tanto, SEC-MALS puede analizar la conformación de los polímeros a través de la relación de la masa molar con R_g. Para moléculas más pequeñas, se agrega DLS o, más comúnmente, un viscosímetro diferencial para determinar el radio hidrodinámico y evaluar la conformación molecular de la misma manera.

En SEC-DLS, los tamaños de las macromoléculas se miden a medida que eluyen en la celda de flujo del instrumento DLS desde el conjunto de columnas de exclusión por tamaño. Se mide el tamaño hidrodinámico de las moléculas o partículas y no sus pesos moleculares. Para las proteínas, se puede utilizar un tipo de cálculo de Mark-Houwink para estimar el peso molecular a partir del tamaño hidrodinámico.

Una de las principales ventajas de DLS junto con SEC es la capacidad de obtener una resolución DLS mejorada. Batch DLS es rápido y simple y proporciona una medida directa del tamaño promedio, pero la resolución de referencia de DLS es una relación de 3:1 en diámetro. Usando SEC, las proteínas y los oligómeros de proteínas se separan, lo que permite la resolución oligomérica. Los estudios de agregación también se pueden realizar utilizando ASEC. Aunque es posible que la concentración del agregado no se calcule con dispersión de luz (un detector de concentración en línea como el que se usa en SEC-MALS para la medición de la masa molar también determina la concentración del agregado), el tamaño del agregado se puede medir, solo limitado por el tamaño máximo que eluyen. de las columnas SEC.

Las limitaciones de ASEC con detección DLS incluyen el caudal, la concentración y la precisión. Debido a que una función de correlación requiere entre 3 y 7 segundos para generarse correctamente, se puede recopilar una cantidad limitada de puntos de datos en el pico. La detección de ASEC con SLS no está limitada por el caudal y el tiempo de medición es esencialmente instantáneo, y el rango de concentración es varios órdenes de magnitud mayor que para DLS. Sin embargo, el análisis de masa molar con SEC-MALS requiere mediciones de concentración precisas. Los detectores MALS y DLS a menudo se combinan en un solo instrumento para un análisis absoluto más completo después de la separación por SEC.