Cromatografía de exclusión molecular

cromatografía de permeación en gel (GPC) es un tipo de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) que separa los analitos en función del tamaño, normalmente en disolventes orgánicos. La técnica se utiliza a menudo para el análisis de polímeros. Como técnica, la SEC fue desarrollada por primera vez en 1955 por Lathe y Ruthven. El término cromatografía de permeación en gel se remonta a J.C. Moore de Dow Chemical Company, quien investigó la técnica en 1964. La tecnología de columna patentada fue licenciada a Waters Corporation, quien posteriormente comercializó esta tecnología en 1964. GPC Los sistemas y consumibles ahora también están disponibles de varios fabricantes. A menudo es necesario separar polímeros, tanto para analizarlos como para purificar el producto deseado.

Al caracterizar los polímeros, es importante tener en cuenta la dispersión (Đ) así como el peso molecular. Los polímeros se pueden caracterizar por una variedad de definiciones de peso molecular, incluido el peso molecular promedio en número (M_n), el peso molecular promedio en peso (M_w) (ver masa molar distribución), el peso molecular promedio del tamaño (M_z), o el peso molecular de la viscosidad (M_v). GPC permite la determinación de Đ así como M_v y, en base a otros datos, el M_n, M_w y M_z se pueden determinar.

Cómo funciona

La GPC separa según el tamaño o el volumen hidrodinámico (radio de giro) de los analitos. Esto difiere de otras técnicas de separación que dependen de interacciones químicas o físicas para separar los analitos. La separación se produce mediante el uso de perlas porosas empaquetadas en una columna (ver fase estacionaria (química)).

Los analitos más pequeños pueden entrar en los poros más fácilmente y, por lo tanto, permanecer más tiempo en estos poros, lo que aumenta su tiempo de retención. Estas moléculas más pequeñas pasan más tiempo en la columna y, por lo tanto, serán las últimas en eluirse. Por el contrario, los analitos más grandes pasan poco o ningún tiempo en los poros y se eluyen rápidamente. Todas las columnas tienen un rango de pesos moleculares que se pueden separar.

Si un analito es demasiado grande, no se conservará; por el contrario, si el analito es demasiado pequeño, puede ser retenido completamente. Los analitos que no se conservan se eliminan con el volumen libre fuera de las partículas (V)_o), mientras que los analitos que se retienen completamente se eluted con volumen de solvente mantenido en los poros (V_i). El volumen total puede ser considerado por la siguiente ecuación, donde V_g es el volumen del gel de polímero y V_t es el volumen total: Vt=Vg+Vi+Vo{displaystyle Vt=Vg+Vi+Vo}

Como se puede inferir, existe un rango limitado de pesos moleculares que puede separar cada columna, por lo que el tamaño de los poros para el relleno debe elegirse de acuerdo con el rango de peso molecular de los analitos a separar. Para las separaciones de polímeros, los tamaños de los poros deben estar en el orden de los polímeros que se analizan. Si una muestra tiene un amplio rango de pesos moleculares, puede ser necesario usar varias columnas GPC en tándem para resolver la muestra por completo.

Solicitud

La GPC se utiliza a menudo para determinar el peso molecular relativo de muestras de polímeros, así como la distribución de pesos moleculares. Lo que GPC realmente mide es el volumen molecular y la función de forma definida por la viscosidad intrínseca. Si se utilizan estándares comparables, estos datos relativos se pueden utilizar para determinar los pesos moleculares con una precisión de ± 5 %. Los estándares de poliestireno con dispersiones de menos de 1,2 se utilizan normalmente para calibrar el GPC. Desafortunadamente, el poliestireno tiende a ser un polímero muy lineal y, por lo tanto, como estándar, solo es útil compararlo con otros polímeros que se sabe que son lineales y relativamente del mismo tamaño.

Material y métodos

Instrumentación

La cromatografía de permeación en gel se realiza casi exclusivamente en columnas de cromatografía. El diseño experimental no es muy diferente de otras técnicas de cromatografía líquida. Las muestras se disuelven en un solvente apropiado, en el caso de GPC estos suelen ser solventes orgánicos y luego de filtrar la solución se inyecta en una columna. La separación de la mezcla de varios componentes tiene lugar en la columna. El suministro constante de eluyente nuevo a la columna se logra mediante el uso de una bomba. Dado que la mayoría de los analitos no son visibles a simple vista, se necesita un detector. A menudo, se utilizan múltiples detectores para obtener información adicional sobre la muestra de polímero. La disponibilidad de un detector hace que el fraccionamiento sea conveniente y preciso.

Gel

Los geles se utilizan como fase estacionaria para GPC. El tamaño de poro de un gel debe controlarse cuidadosamente para poder aplicar el gel a una separación determinada. Otras propiedades deseables del agente formador de gel son la ausencia de grupos ionizantes y, en un disolvente dado, baja afinidad por las sustancias a separar. Geles comerciales como PLgel & Styragel (poliestireno-divinilbenceno reticulado), LH-20 (Sephadex hidroxipropilado), Bio-Gel (poliacrilamida reticulada), HW-20 & HW-40 (polímero metacrílico hidroxilado), gel de agarosa y se utilizan a menudo en función de diferentes requisitos de separación.

Columna

La columna utilizada para GPC está llena de un material de relleno microporoso. La columna se llena con el gel.

Eluyente

El eluyente (fase móvil) debe ser un buen solvente para el polímero, debe permitir una alta respuesta del detector del polímero y debe humedecer la superficie de empaque. Los eluyentes más comunes para polímeros que se disuelven a temperatura ambiente GPC son tetrahidrofurano (THF), o-diclorobenceno y triclorobenceno a 130-150 °C para polialquinos cristalinos y hexafluoroisopropanol (HFIP) para polímeros de condensación cristalinos como poliamidas y poliésteres.

Bomba

Hay dos tipos de bombas disponibles para la entrega uniforme de volúmenes de líquido relativamente pequeños para GPC: bombas de pistón o peristálticas.

Detector

En GPC, la concentración en peso de polímero en el disolvente de elución puede controlarse continuamente con un detector. Hay muchos tipos de detectores disponibles y se pueden dividir en dos categorías principales. El primero son los detectores sensibles a la concentración, que incluyen absorción UV, refractómetro diferencial (DRI) o detectores de índice de refracción (RI), absorción infrarroja (IR) y detectores de densidad. La segunda categoría son los detectores sensibles al peso molecular, que incluyen detectores de dispersión de luz de ángulo bajo (LALLS) y de dispersión de luz de múltiples ángulos (MALLS). El cromatograma resultante es, por lo tanto, una distribución de peso del polímero en función del volumen de retención.

El detector más sensible es el fotómetro UV diferencial y el detector más común es el refractómetro diferencial (DRI). Al caracterizar copolímeros, es necesario tener dos detectores en serie. Para determinaciones precisas de la composición del copolímero, al menos dos de esos detectores deben ser detectores de concentración. La determinación de la mayoría de las composiciones de copolímeros se realiza mediante detectores UV y RI, aunque se pueden utilizar otras combinaciones.

Análisis de datos

La cromatografía de permeación en gel (GPC) se ha convertido en la técnica más utilizada para analizar muestras de polímeros con el fin de determinar sus pesos moleculares y distribuciones de peso. A la izquierda se muestran ejemplos de cromatogramas GPC de muestras de poliestireno con sus pesos moleculares y dispersidades.

Benoit y colaboradores propusieron que el volumen hidrodinámico, V_η, que es proporcional al producto de [η] y M, donde [η] es la viscosidad intrínseca del polímero en el El eluyente SEC, se puede utilizar como parámetro de calibración universal. Si se conocen las constantes K y α de Mark-Houwink-Sakurada (consulte la ecuación de Mark-Houwink), una gráfica de log [η]M versus el volumen de elución (o tiempo de elución) para un solvente, columna e instrumento en particular proporciona una curva de calibración universal que se puede utilizar para cualquier polímero en ese disolvente. Al determinar los volúmenes (o tiempos) de retención de estándares de polímeros monodispersos (p. ej., soluciones de poliestireno monodisperso en THF), se puede obtener una curva de calibración representando el logaritmo del peso molecular frente al tiempo o volumen de retención. Una vez obtenida la curva de calibración, se puede obtener el cromatograma de permeación en gel de cualquier otro polímero en el mismo disolvente y los pesos moleculares (normalmente M_n y M_w) y el puede determinarse la distribución completa del peso molecular del polímero. A la derecha se muestra una curva de calibración típica y el peso molecular de una muestra desconocida se puede obtener de la curva de calibración.

Ventajas

Como técnica de separación, GPC tiene muchas ventajas. En primer lugar, tiene un tiempo de separación bien definido debido a que existe un volumen de elución final para todos los analitos no retenidos. Además, GPC puede proporcionar bandas estrechas, aunque este aspecto de GPC es más difícil para las muestras de polímeros que tienen presentes amplios rangos de pesos moleculares. Finalmente, dado que los analitos no interactúan química o físicamente con la columna, existe una probabilidad menor de que se produzca una pérdida de analitos. Para investigar las propiedades de las muestras de polímeros en particular, GPC puede ser muy ventajoso. GPC proporciona un método más conveniente para determinar los pesos moleculares de los polímeros. De hecho, la mayoría de las muestras se pueden analizar a fondo en una hora o menos. Otros métodos utilizados en el pasado fueron la extracción fraccionada y la precipitación fraccionada. Como estos procesos requerían mucha mano de obra, los pesos moleculares y las distribuciones de masa normalmente no se analizaban. Por lo tanto, GPC ha permitido la estimación rápida y relativamente fácil de los pesos moleculares y la distribución de muestras de polímeros.

Desventajas

Sin embargo, GPC tiene desventajas. En primer lugar, hay un número limitado de picos que se pueden resolver dentro de la breve escala de tiempo de la ejecución de GPC. Además, como técnica, la GPC requiere alrededor de al menos un 10 % de diferencia en el peso molecular para que se produzca una resolución razonable de los picos. Con respecto a los polímeros, las masas moleculares de la mayoría de las cadenas serán demasiado cercanas para que la separación por GPC muestre algo más que picos amplios. Otra desventaja de GPC para polímeros es que las filtraciones deben realizarse antes de usar el instrumento para evitar que el polvo y otras partículas arruinen las columnas e interfieran con los detectores. Aunque es útil para proteger el instrumento, existe la posibilidad de que la filtración previa de la muestra elimine la muestra de mayor peso molecular antes de que pueda cargarse en la columna. Otra posibilidad para superar estos problemas es la separación por fraccionamiento de flujo de campo (FFF).

Métodos ortogonales

El fraccionamiento de flujo de campo (FFF) se puede considerar como una alternativa a la GPC, especialmente cuando las partículas o los polímeros de masa molar alta obstruyen la columna, la degradación por cizallamiento es un problema o se produce aglomeración pero no se puede hacer visible. FFF es la separación en un canal de flujo abierto sin que haya una fase estática involucrada, por lo que no se producen interacciones. Con una versión de fraccionamiento de flujo de campo, el fraccionamiento de flujo de campo térmico, es posible la separación de polímeros que tienen el mismo tamaño pero diferentes composiciones químicas.