Cristalografía de rayos X

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La cristalografía de rayos X (a veces difracción de rayos X) es la ciencia experimental que determina la estructura atómica y molecular de un cristal, en la que la estructura cristalina hace que un haz de rayos X incidentes se difracte en muchas direcciones específicas. Al medir los ángulos y las intensidades de estos rayos difractados, un cristalógrafo puede producir una imagen tridimensional de la densidad de electrones dentro del cristal. A partir de esta densidad electrónica, se pueden determinar las posiciones medias de los átomos en el cristal, así como sus enlaces químicos, su desorden cristalográfico y otra información diversa.

Dado que muchos materiales pueden formar cristales, como sales, metales, minerales, semiconductores, así como diversas moléculas inorgánicas, orgánicas y biológicas, la cristalografía de rayos X ha sido fundamental en el desarrollo de muchos campos científicos. En sus primeras décadas de uso, este método determinó el tamaño de los átomos, las longitudes y tipos de enlaces químicos y las diferencias de escala atómica entre varios materiales, especialmente minerales y aleaciones. El método también reveló la estructura y función de muchas moléculas biológicas, incluidas vitaminas, fármacos, proteínas y ácidos nucleicos como el ADN. La cristalografía de rayos X sigue siendo el método principal para caracterizar la estructura atómica de nuevos materiales y discernir materiales que parecen similares en otros experimentos.

En una medición de difracción de rayos X de un solo cristal, se monta un cristal en un goniómetro. El goniómetro se utiliza para colocar el cristal en orientaciones seleccionadas. El cristal se ilumina con un haz monocromático de rayos X finamente enfocado, lo que produce un patrón de difracción de puntos espaciados regularmente conocidos como reflejos. Las imágenes bidimensionales tomadas en diferentes orientaciones se convierten en un modelo tridimensional de la densidad de electrones dentro del cristal utilizando el método matemático de transformadas de Fourier, combinado con datos químicos conocidos de la muestra. Una mala resolución (borrosidad) o incluso errores pueden resultar si los cristales son demasiado pequeños o no lo suficientemente uniformes en su composición interna.

La cristalografía de rayos X está relacionada con varios otros métodos para determinar estructuras atómicas. Se pueden producir patrones de difracción similares mediante la dispersión de electrones o neutrones, que también se interpretan mediante la transformación de Fourier. Si no se pueden obtener monocristales de tamaño suficiente, se pueden aplicar otros métodos de rayos X para obtener información menos detallada; tales métodos incluyen difracción de fibra, difracción de polvo y (si la muestra no está cristalizada) dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS). Si el material bajo investigación solo está disponible en forma de polvos nanocristalinos o sufre de mala cristalinidad, los métodos de cristalografía electrónica se pueden aplicar para determinar la estructura atómica.

Para todos los métodos de difracción de rayos X mencionados anteriormente, la dispersión es elástica; los rayos X dispersados tienen la misma longitud de onda que los rayos X entrantes. Por el contrario, los métodos de dispersión de rayos X inelásticos son útiles para estudiar las excitaciones de la muestra, como plasmones, campo cristalino y excitaciones orbitales, magnones y fonones, en lugar de la distribución de sus átomos.

Historia

Historia científica temprana de cristales y rayos X.

Los cristales, aunque admirados durante mucho tiempo por su regularidad y simetría, no fueron investigados científicamente hasta el siglo XVII. Johannes Kepler planteó la hipótesis en su obra Strena seu de Nive Sexangula (Un regalo de año nuevo de nieve hexagonal) (1611) que la simetría hexagonal de los cristales de copos de nieve se debía a un empaquetamiento regular de partículas de agua esféricas.

El científico danés Nicolas Steno (1669) fue pionero en las investigaciones experimentales de la simetría de los cristales. Steno demostró que los ángulos entre las caras son los mismos en cada ejemplar de un tipo particular de cristal,y René Just Haüy (1784) descubrieron que cada cara de un cristal se puede describir mediante simples patrones de apilamiento de bloques de la misma forma y tamaño. Por lo tanto, William Hallowes Miller en 1839 pudo dar a cada cara una etiqueta única de tres pequeños números enteros, los índices de Miller que siguen en uso hoy en día para identificar las caras de los cristales. El estudio de Haüy condujo a la idea correcta de que los cristales son una matriz tridimensional regular (una red de Bravais) de átomos y moléculas; una sola celda unitaria se repite indefinidamente a lo largo de tres direcciones principales que no son necesariamente perpendiculares. En el siglo XIX, Johan Hessel, Auguste Bravais, Evgraf Fedorov, Evgraf Fedorov, elaboraron un catálogo completo de las posibles simetrías de un cristal.Arthur Schönflies y (tardíamente) William Barlow (1894). A partir de los datos disponibles y el razonamiento físico, Barlow propuso varias estructuras cristalinas en la década de 1880 que luego fueron validadas por cristalografía de rayos X; sin embargo, los datos disponibles eran demasiado escasos en la década de 1880 para aceptar sus modelos como concluyentes.

Wilhelm Röntgen descubrió los rayos X en 1895, justo cuando se completaban los estudios de simetría de los cristales. Los físicos no estaban seguros de la naturaleza de los rayos X, pero pronto sospecharon que eran ondas de radiación electromagnética, una forma de luz. La teoría de Maxwell de la radiación electromagnética fue bien aceptada entre los científicos, y los experimentos de Charles Glover Barkla mostraron que los rayos X exhibían fenómenos asociados con las ondas electromagnéticas, incluida la polarización transversal y líneas espectrales similares a las observadas en las longitudes de onda visibles. Barkla también creó la notación de rayos X, notando en 1909 dos tipos separados de haces de difracción, al principio, nombrándolos "A" y "B" y luego suponiendo que puede haber líneas antes de "A", comenzó un numeración alfabética que comienza con "K".Los experimentos de una sola rendija en el laboratorio de Arnold Sommerfeld sugirieron que los rayos X tenían una longitud de onda de alrededor de 1 angstrom. Los rayos X no son solo ondas, sino también fotones, y tienen propiedades de partículas que hacen que Sommerfeld acuñe el nombre, Bremsstrahlung, para este tipo de difracción ondulatoria. Albert Einstein introdujo el concepto de fotón en 1905, pero no fue ampliamente aceptado hasta 1922, cuando Arthur Compton lo confirmó mediante la dispersión de rayos X de los electrones. Las propiedades de partículas de los rayos X, como la ionización de los gases, llevaron a William Henry Bragg a argumentar en 1907 que los rayos X no eran radiación electromagnética. La opinión de Bragg resultó impopular y la observación de la difracción de rayos X por Max von Laue en 1912confirmó para la mayoría de los científicos que los rayos X son una forma de radiación electromagnética.

Difracción de rayos X

Los cristales son arreglos regulares de átomos, y los rayos X pueden considerarse ondas de radiación electromagnética. Los átomos dispersan ondas de rayos X, principalmente a través de los electrones de los átomos. Así como una ola del océano que golpea un faro produce ondas circulares secundarias que emanan del faro, un rayo X que golpea un electrón produce ondas esféricas secundarias que emanan del electrón. Este fenómeno se conoce como dispersión elástica, y el electrón (o faro) se conoce como el dispersor. Un arreglo regular de dispersores produce un arreglo regular de ondas esféricas. Aunque estas ondas se anulan entre sí en la mayoría de las direcciones a través de la interferencia destructiva, se suman constructivamente en algunas direcciones específicas, determinadas por la ley de Bragg: ${ estilo de visualización n lambda = 2d sin theta}$

Aquí d es el espacio entre los planos de difracción, $theta$ es el ángulo de incidencia, n es cualquier número entero y λ es la longitud de onda del haz. Estas direcciones específicas aparecen como puntos en el patrón de difracción llamados reflejos. Por lo tanto, la difracción de rayos X es el resultado de una onda electromagnética (los rayos X) que incide sobre una serie regular de dispersores (la disposición repetitiva de los átomos dentro del cristal).

Los rayos X se utilizan para producir el patrón de difracción porque su longitud de onda λ es típicamente del mismo orden de magnitud (1–100 angstroms) que el espaciado dentre planos en el cristal. En principio, cualquier onda que incide sobre un conjunto regular de dispersores produce difracción, como predijo por primera vez Francesco Maria Grimaldi en 1665. Para producir una difracción significativa, el espacio entre los dispersores y la longitud de onda de la onda incidente debe ser de tamaño similar. A modo de ilustración, James Gregory informó por primera vez sobre la difracción de la luz solar a través de la pluma de un pájaro a fines del siglo XVII. Las primeras rejillas de difracción artificial para luz visible fueron construidas por David Rittenhouse en 1787 y Joseph von Fraunhofer en 1821. Sin embargo, la luz visible tiene una longitud de onda demasiado larga (típicamente, 5500 angstroms) para observar la difracción de los cristales. Antes de los primeros experimentos de difracción de rayos X, los espacios entre los planos de la red en un cristal no se conocían con certeza.

La idea de que los cristales podrían usarse como rejilla de difracción para rayos X surgió en 1912 en una conversación entre Paul Peter Ewald y Max von Laue en el Jardín Inglés de Munich. Ewald había propuesto un modelo de resonador de cristales para su tesis, pero este modelo no pudo validarse usando luz visible, ya que la longitud de onda era mucho mayor que el espacio entre los resonadores. Von Laue se dio cuenta de que se necesitaba radiación electromagnética de una longitud de onda más corta para observar espaciamientos tan pequeños y sugirió que los rayos X podrían tener una longitud de onda comparable al espaciamiento de celda unitaria en los cristales. Von Laue trabajó con dos técnicos, Walter Friedrich y su asistente Paul Knipping, para hacer brillar un haz de rayos X a través de un cristal de sulfato de cobre y registrar su difracción en una placa fotográfica. Después de ser desarrollado,Von Laue desarrolló una ley que conecta los ángulos de dispersión y el tamaño y la orientación de los espaciamientos de celdas unitarias en el cristal, por lo que recibió el Premio Nobel de Física en 1914.

Dispersión

Como se describe en la derivación matemática a continuación, la dispersión de rayos X está determinada por la densidad de electrones dentro del cristal. Dado que la energía de un rayo X es mucho mayor que la de un electrón de valencia, la dispersión puede modelarse como dispersión de Thomson, la interacción de un rayo electromagnético con un electrón libre. Este modelo se adopta generalmente para describir la polarización de la radiación dispersa.

La intensidad de la dispersión de Thomson para una partícula con masa m y carga elemental q es: $I_o = I_e left(frac{q^4}{m^2c^4}right)frac{1+cos^22theta}{2} = I_e7.94.10^{-26}frac{ 1+cos^22theta}{2} = I_ef$

Por lo tanto, los núcleos atómicos, que son mucho más pesados que un electrón, contribuyen de manera insignificante a los rayos X dispersados.

Desarrollo de 1912 a 1920

Después de la investigación pionera de Von Laue, el campo se desarrolló rápidamente, sobre todo por los físicos William Lawrence Bragg y su padre William Henry Bragg. En 1912-1913, el joven Bragg desarrolló la ley de Bragg, que conecta la dispersión observada con reflejos de planos espaciados uniformemente dentro del cristal. Los Bragg, padre e hijo, compartieron el Premio Nobel de Física de 1915 por su trabajo en cristalografía. Las primeras estructuras eran generalmente simples y estaban marcadas por una simetría unidimensional. Sin embargo, a medida que los métodos computacionales y experimentales mejoraron durante las próximas décadas, se volvió factible deducir posiciones atómicas confiables para arreglos de átomos bidimensionales y tridimensionales más complicados en la celda unitaria.

El potencial de la cristalografía de rayos X para determinar la estructura de las moléculas y los minerales, que entonces solo se conocía vagamente a partir de experimentos químicos e hidrodinámicos, se realizó de inmediato. Las primeras estructuras eran cristales y minerales inorgánicos simples, pero incluso estos revelaron leyes fundamentales de la física y la química. La primera estructura de resolución atómica que se "resolvió" (es decir, se determinó) en 1914 fue la de la sal de mesa. La distribución de electrones en la estructura de la sal de mesa mostró que los cristales no están necesariamente compuestos por moléculas unidas covalentemente y probó la existencia de compuestos iónicos. La estructura del diamante se resolvió en el mismo año,probando la disposición tetraédrica de sus enlaces químicos y mostrando que la longitud del enlace simple C-C era de 1,52 angstroms. Otras estructuras tempranas incluyeron cobre, fluoruro de calcio (CaF ₂, también conocido como fluorita), calcita (CaCO ₃) y pirita (FeS ₂) en 1914; espinela (MgAl ₂ O ₄) en 1915; las formas rutilo y anatasa del dióxido de titanio (TiO ₂) en 1916; pirocroita Mn(OH) ₂ y, por extensión, brucita Mg(OH) ₂ en 1919. También en 1919, nitrato de sodio (NaNO ₃) y dicloroyoduro de cesio (CsICl ₂) fueron determinados por Ralph Walter Graystone Wyckoff, y la estructura de wurtzita (ZnS hexagonal) se conoció en 1920.

La estructura del grafito se resolvió en 1916 mediante el método relacionado de difracción de polvo, que fue desarrollado por Peter Debye y Paul Scherrer e, independientemente, por Albert Hull en 1917. La estructura del grafito se determinó a partir de la difracción de un solo cristal en 1924 por dos grupos de forma independiente. Hull también utilizó el método del polvo para determinar las estructuras de varios metales, como el hierro y el magnesio.

Importancia cultural y estética

En 1951, el Festival Pattern Group en el Festival de Gran Bretaña acogió a un grupo colaborativo de fabricantes textiles y cristalógrafos experimentados para diseñar encajes y estampados basados en la cristalografía de rayos X de insulina, arcilla china y hemoglobina. Una de las principales científicas del proyecto fue la Dra. Helen Megaw (1907–2002), subdirectora de investigación del Laboratorio Cavendish de Cambridge en ese momento. A Megaw se le acredita como una de las figuras centrales que se inspiró en los diagramas de cristal y vio su potencial en el diseño. En 2008, la Wellcome Collection de Londres organizó una exposición sobre el Festival Pattern Group llamada "From Atom to Patterns".

Contribuciones a la química y la ciencia de los materiales.

La cristalografía de rayos X ha llevado a una mejor comprensión de los enlaces químicos y las interacciones no covalentes. Los estudios iniciales revelaron los radios típicos de los átomos y confirmaron muchos modelos teóricos de enlace químico, como el enlace tetraédrico del carbono en la estructura del diamante, el enlace octaédrico de los metales observado en el hexacloroplatinato de amonio (IV) y la resonancia observada en el grupo carbonato plano y en moléculas aromáticas. La estructura del hexametilbenceno de Kathleen Lonsdale de 1928 estableció la simetría hexagonal del benceno y mostró una clara diferencia en la longitud del enlace entre los enlaces C-C alifáticos y los enlaces C-C aromáticos; este hallazgo condujo a la idea de resonancia entre enlaces químicos, que tuvo profundas consecuencias para el desarrollo de la química.Sus conclusiones fueron anticipadas por William Henry Bragg, quien publicó modelos de naftaleno y antraceno en 1921 basados en otras moléculas, una forma temprana de reemplazo molecular.

También en la década de 1920, Victor Moritz Goldschmidt y más tarde Linus Pauling desarrollaron reglas para eliminar estructuras químicamente improbables y para determinar los tamaños relativos de los átomos. Estas reglas condujeron a la estructura de la brookita (1928) y a la comprensión de la estabilidad relativa de las formas de rutilo, brookita y anatasa del dióxido de titanio.

La distancia entre dos átomos enlazados es una medida sensible de la fuerza del enlace y su orden de enlace; por lo tanto, los estudios cristalográficos de rayos X han llevado al descubrimiento de tipos de enlace aún más exóticos en la química inorgánica, como los enlaces dobles metal-metal, los enlaces cuádruples metal-metal y los enlaces de tres centros y dos electrones. La cristalografía de rayos X, o, estrictamente hablando, un experimento de dispersión inelástica de Compton, también ha proporcionado evidencia del carácter parcialmente covalente de los enlaces de hidrógeno. En el campo de la química organometálica, la estructura de rayos X del ferroceno inició los estudios científicos de los compuestos tipo sándwich, mientras que la de la sal de Zeise estimuló la investigación sobre los complejos de "back bonding" y metal-pi.Finalmente, la cristalografía de rayos X tuvo un papel pionero en el desarrollo de la química supramolecular, particularmente en la clarificación de las estructuras de los éteres corona y los principios de la química huésped-huésped.

La difracción de rayos X es una herramienta muy poderosa en el desarrollo de catalizadores. Las mediciones ex situ se llevan a cabo de forma rutinaria para comprobar la estructura cristalina de los materiales o para desentrañar nuevas estructuras. Los experimentos in situ brindan una comprensión integral de la estabilidad estructural de los catalizadores en condiciones de reacción.

En las ciencias de los materiales, se han analizado muchos sistemas inorgánicos y organometálicos complicados utilizando métodos monocristalinos, como fullerenos, metaloporfirinas y otros compuestos complicados. La difracción de un solo cristal también se usa en la industria farmacéutica, debido a problemas recientes con los polimorfos. Los principales factores que afectan la calidad de las estructuras monocristalinas son el tamaño y la regularidad del cristal; la recristalización es una técnica comúnmente utilizada para mejorar estos factores en cristales de molécula pequeña. La base de datos estructural de Cambridge contiene más de 1 000 000 de estructuras a partir de junio de 2019; más del 99% de estas estructuras se determinaron por difracción de rayos X.

Mineralogía y metalurgia

Desde la década de 1920, la difracción de rayos X ha sido el principal método para determinar la disposición de los átomos en minerales y metales. La aplicación de la cristalografía de rayos X a la mineralogía comenzó con la estructura del granate, que fue determinada en 1924 por Menzer. En la década de 1920 se llevó a cabo un estudio cristalográfico sistemático de rayos X de los silicatos. Este estudio mostró que, a medida que se altera la relación Si/O, los cristales de silicato exhiben cambios significativos en sus arreglos atómicos. Machatschki amplió estas ideas a los minerales en los que el aluminio sustituye a los átomos de silicio de los silicatos. La primera aplicación de la cristalografía de rayos X a la metalurgia también se produjo a mediados de la década de 1920. En particular, la estructura de Linus Pauling de la aleación Mg ₂ Sncondujo a su teoría de la estabilidad y estructura de los cristales iónicos complejos.

El 17 de octubre de 2012, el rover Curiosity en el planeta Marte en "Rocknest" realizó el primer análisis de difracción de rayos X del suelo marciano. Los resultados del analizador CheMin del rover revelaron la presencia de varios minerales, incluidos feldespato, piroxenos y olivino, y sugirieron que el suelo marciano en la muestra era similar a los "suelos basálticos erosionados" de los volcanes hawaianos.

Primeras moléculas biológicas orgánicas y pequeñas

La primera estructura de un compuesto orgánico, la hexametilentetramina, se resolvió en 1923. A esto le siguieron varios estudios de ácidos grasos de cadena larga, que son un componente importante de las membranas biológicas. En la década de 1930, comenzaron a resolverse las estructuras de moléculas mucho más grandes con complejidad bidimensional. Un avance significativo fue la estructura de la ftalocianina, una molécula plana grande que está estrechamente relacionada con las moléculas de porfirina importantes en biología, como el hemo, la corrina y la clorofila.

La cristalografía de rayos X de moléculas biológicas despegó con Dorothy Crowfoot Hodgkin, quien resolvió las estructuras del colesterol (1937), la penicilina (1946) y la vitamina B ₁₂ (1956), por lo que recibió el Premio Nobel de Química en 1964. En 1969, logró resolver la estructura de la insulina, en la que trabajó durante más de treinta años.

Cristalografía macromolecular biológica

Las estructuras cristalinas de las proteínas (que son irregulares y cientos de veces más grandes que el colesterol) comenzaron a resolverse a fines de la década de 1950, comenzando con la estructura de la mioglobina de cachalote de Sir John Cowdery Kendrew, por la cual compartió el Premio Nobel de Química con Max Perutz en 1962. Desde ese éxito, se han determinado más de 130.000 estructuras cristalinas de rayos X de proteínas, ácidos nucleicos y otras moléculas biológicas. El método competidor más cercano en número de estructuras analizadas es la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), que ha resuelto menos de una décima parte.La cristalografía puede resolver estructuras de moléculas arbitrariamente grandes, mientras que la RMN en estado de solución está restringida a moléculas relativamente pequeñas (menos de 70 kDa). La cristalografía de rayos X se usa de forma rutinaria para determinar cómo un fármaco interactúa con su objetivo proteico y qué cambios podrían mejorarlo. Sin embargo, las proteínas de membrana intrínsecas siguen siendo difíciles de cristalizar porque requieren detergentes u otros desnaturalizantes para solubilizarlas de forma aislada, y dichos detergentes a menudo interfieren con la cristalización. Las proteínas de membrana son un gran componente del genoma e incluyen muchas proteínas de gran importancia fisiológica, como los canales iónicos y los receptores. La criogenia con helio se utiliza para prevenir el daño por radiación en los cristales de proteínas.

En el otro extremo de la escala de tamaño, incluso las moléculas relativamente pequeñas pueden plantear desafíos para el poder de resolución de la cristalografía de rayos X. La estructura asignada en 1991 al antibiótico aislado de un organismo marino, la diazonamida A (C ₄₀ H ₃₄ Cl ₂ N ₆ O ₆, masa molar 765,65 g/mol), resultó ser incorrecta mediante la clásica prueba de estructura: una muestra sintética no era idéntico al producto natural. El error se atribuyó a la incapacidad de la cristalografía de rayos X para distinguir entre los grupos -OH / -NH correctos y los grupos -NH ₂ / -O- intercambiados en la estructura incorrecta.Sin embargo, con los avances en la instrumentación, se pueden distinguir grupos similares utilizando modernos difractómetros de rayos X monocristalinos.

A pesar de ser una herramienta invaluable en biología estructural, la cristalografía de proteínas conlleva algunos problemas inherentes a su metodología que dificultan la interpretación de los datos. La red cristalina, que se forma durante el proceso de cristalización, contiene numerosas unidades de la proteína purificada, que se empaquetan densa y simétricamente en el cristal. Al buscar una proteína previamente desconocida, descubrir su forma y límites dentro de la red cristalina puede ser un desafío. Las proteínas generalmente se componen de subunidades más pequeñas, y la tarea de distinguir entre las subunidades e identificar la proteína real puede ser un desafío incluso para los cristalógrafos experimentados. Las interfaces no biológicas que ocurren durante la cristalización se conocen como contactos de empaquetamiento de cristal (o simplemente, contactos de cristal) y no se pueden distinguir por medios cristalográficos. Cuando se resuelve una nueva estructura proteica mediante cristalografía de rayos X y se deposita en el Banco de datos de proteínas, se solicita a sus autores que especifiquen el "ensamblaje biológico" que constituiría la proteína funcional biológicamente relevante. Sin embargo, los errores, los datos faltantes y las anotaciones inexactas durante el envío de los datos dan lugar a estructuras oscuras y comprometen la confiabilidad de la base de datos. Se ha informado que la tasa de error en el caso de anotaciones defectuosas supera el 6,6% la falta de datos y las anotaciones inexactas durante el envío de los datos dan lugar a estructuras oscuras y comprometen la fiabilidad de la base de datos. Se ha informado que la tasa de error en el caso de anotaciones defectuosas supera el 6,6% la falta de datos y las anotaciones inexactas durante el envío de los datos dan lugar a estructuras oscuras y comprometen la fiabilidad de la base de datos. Se ha informado que la tasa de error en el caso de anotaciones defectuosas supera el 6,6%o aproximadamente el 15%, posiblemente un tamaño no trivial considerando el número de estructuras depositadas. Este "problema de clasificación de interfaz" generalmente se aborda mediante enfoques computacionales y se ha convertido en un tema reconocido en bioinformática estructural.

Técnicas de dispersión

Dispersión elástica frente a inelástica

La cristalografía de rayos X es una forma de dispersión elástica; los rayos X salientes tienen la misma energía y, por lo tanto, la misma longitud de onda que los rayos X entrantes, solo que con dirección alterada. Por el contrario, la dispersión inelástica se produce cuando se transfiere energía de los rayos X entrantes al cristal, por ejemplo, al excitar un electrón de la capa interna a un nivel de energía superior. Tal dispersión inelástica reduce la energía (o aumenta la longitud de onda) del haz saliente. La dispersión inelástica es útil para probar tales excitaciones de la materia, pero no para determinar la distribución de los dispersores dentro de la materia, que es el objetivo de la cristalografía de rayos X.

Los rayos X varían en longitud de onda de 10 a 0,01 nanómetros; una longitud de onda típica utilizada para la cristalografía es 1 Å (0,1 nm), que está en la escala de los enlaces químicos covalentes y el radio de un solo átomo. Los fotones de mayor longitud de onda (como la radiación ultravioleta) no tendrían suficiente resolución para determinar las posiciones atómicas. En el otro extremo, los fotones de longitud de onda más corta, como los rayos gamma, son difíciles de producir en grandes cantidades, difíciles de enfocar e interactúan con demasiada fuerza con la materia, produciendo pares de partículas y antipartículas. Por lo tanto, los rayos X son el "punto óptimo" para la longitud de onda al determinar las estructuras de resolución atómica a partir de la dispersión de la radiación electromagnética.

Otras técnicas de rayos X

Otras formas de dispersión elástica de rayos X además de la difracción de un solo cristal incluyen la difracción de polvo, la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) y varios tipos de difracción de fibra de rayos X, que fue utilizada por Rosalind Franklin para determinar la estructura de doble hélice. de ADN En general, la difracción de rayos X de un solo cristal ofrece más información estructural que estas otras técnicas; sin embargo, requiere un cristal suficientemente grande y regular, que no siempre está disponible.

Estos métodos de dispersión generalmente usan rayos X monocromáticos, que están restringidos a una sola longitud de onda con desviaciones menores. También se puede utilizar un amplio espectro de rayos X (es decir, una combinación de rayos X con diferentes longitudes de onda) para llevar a cabo la difracción de rayos X, una técnica conocida como método de Laue. Este es el método utilizado en el descubrimiento original de la difracción de rayos X. La dispersión de Laue proporciona mucha información estructural con solo una breve exposición al haz de rayos X y, por lo tanto, se utiliza en estudios estructurales de eventos muy rápidos (cristalografía resuelta en el tiempo). Sin embargo, no es tan adecuado como la dispersión monocromática para determinar la estructura atómica completa de un cristal y, por lo tanto, funciona mejor con cristales con arreglos atómicos relativamente simples.

El modo de retrorreflexión de Laue registra los rayos X dispersados hacia atrás desde una fuente de amplio espectro. Esto es útil si la muestra es demasiado gruesa para que los rayos X se transmitan a través de ella. Los planos de difracción en el cristal se determinan sabiendo que la normal al plano de difracción biseca el ángulo entre el haz incidente y el haz difractado. Se puede utilizar una carta de Greninger para interpretar la fotografía de Laue de reflexión posterior.

Difracción de electrones y neutrones

Se pueden usar otras partículas, como electrones y neutrones, para producir un patrón de difracción. Aunque la dispersión de electrones, neutrones y rayos X se basan en diferentes procesos físicos, los patrones de difracción resultantes se analizan utilizando las mismas técnicas coherentes de formación de imágenes de difracción.

Como se deriva a continuación, la densidad de electrones dentro del cristal y los patrones de difracción están relacionados mediante un método matemático simple, la transformada de Fourier, que permite calcular la densidad con relativa facilidad a partir de los patrones. Sin embargo, esto solo funciona si la dispersión es débil., es decir, si los rayos dispersados son mucho menos intensos que el rayo entrante. Los rayos débilmente dispersados atraviesan el resto del cristal sin sufrir un segundo evento de dispersión. Estas ondas redispersadas se denominan "dispersión secundaria" y dificultan el análisis. Cualquier cristal suficientemente grueso producirá una dispersión secundaria, pero dado que los rayos X interactúan relativamente débilmente con los electrones, esto generalmente no es una preocupación importante. Por el contrario, los haces de electrones pueden producir una fuerte dispersión secundaria incluso para cristales relativamente delgados (>100 nm). Dado que este espesor corresponde al diámetro de muchos virus, una dirección prometedora es la difracción de electrones de conjuntos macromoleculares aislados, como cápsides virales y máquinas moleculares, que pueden llevarse a cabo con un microscopio crioelectrónico. Además, la fuerte interacción de los electrones con la materia (alrededor de 1000 veces más fuerte que la de los rayos X) permite la determinación de la estructura atómica de volúmenes extremadamente pequeños. El campo de aplicaciones de la cristalografía electrónica abarca desde biomoléculas como proteínas de membrana sobre películas orgánicas delgadas hasta estructuras complejas de compuestos intermetálicos (nanocristalinos) y zeolitas.

La difracción de neutrones es un método excelente para la determinación de estructuras, aunque ha sido difícil obtener haces de neutrones monocromáticos e intensos en cantidades suficientes. Tradicionalmente, se han utilizado reactores nucleares, aunque las fuentes que producen neutrones por espalación están cada vez más disponibles. Al no tener carga, los neutrones se dispersan mucho más fácilmente desde los núcleos atómicos que desde los electrones. Por lo tanto, la dispersión de neutrones es muy útil para observar las posiciones de los átomos ligeros con pocos electrones, especialmente el hidrógeno, que es esencialmente invisible en la difracción de rayos X. La dispersión de neutrones también tiene la notable propiedad de que el solvente puede hacerse invisible ajustando la proporción de agua normal, H ₂ O, y agua pesada, D ₂ O.

Métodos

Descripción general de la difracción de rayos X de un solo cristal

El método más antiguo y preciso de cristalografía de rayos X es la difracción de rayos X de un solo cristal, en la que un haz de rayos X golpea un solo cristal, produciendo haces dispersos. Cuando aterrizan en un trozo de película u otro detector, estos haces forman un patrón de difracción de puntos; las intensidades y los ángulos de estos haces se registran a medida que el cristal gira gradualmente. Cada punto se llama un reflejo., ya que corresponde a la reflexión de los rayos X de un conjunto de planos uniformemente espaciados dentro del cristal. Para monocristales de suficiente pureza y regularidad, los datos de difracción de rayos X pueden determinar las longitudes y ángulos medios de los enlaces químicos con una precisión de unas pocas milésimas de angstrom y unas pocas décimas de grado, respectivamente. Los átomos en un cristal no son estáticos, sino que oscilan alrededor de sus posiciones medias, por lo general menos de unas pocas décimas de angstrom. La cristalografía de rayos X permite medir el tamaño de estas oscilaciones.

Procedimiento

La técnica de cristalografía de rayos X de un solo cristal consta de tres pasos básicos. El primer paso, ya menudo el más difícil, es obtener un cristal adecuado del material en estudio. El cristal debe ser suficientemente grande (normalmente mayor de 0,1 mm en todas las dimensiones), de composición pura y estructura regular, sin imperfecciones internas significativas como grietas o maclas.

En el segundo paso, el cristal se coloca en un haz intenso de rayos X, generalmente de una sola longitud de onda (rayos X monocromáticos), produciendo el patrón regular de reflejos. Se miden los ángulos y las intensidades de los rayos X difractados, y cada compuesto tiene un patrón de difracción único. A medida que el cristal se gira gradualmente, los reflejos anteriores desaparecen y aparecen otros nuevos; la intensidad de cada punto se registra en cada orientación del cristal. Es posible que se deban recopilar varios conjuntos de datos, y cada conjunto cubre un poco más de la mitad de una rotación completa del cristal y, por lo general, contiene decenas de miles de reflejos.

En el tercer paso, estos datos se combinan computacionalmente con información química complementaria para producir y refinar un modelo de la disposición de los átomos dentro del cristal. El modelo final y refinado del arreglo atómico, ahora llamado estructura cristalina, generalmente se almacena en una base de datos pública.

Limitaciones

A medida que la unidad repetitiva del cristal, su celda unitaria, se vuelve más grande y más compleja, la imagen a nivel atómico proporcionada por la cristalografía de rayos X se vuelve menos resuelta (más "borrosa") para un número determinado de reflexiones observadas. A menudo se distinguen dos casos limitantes de cristalografía de rayos X: "molécula pequeña" (que incluye sólidos inorgánicos continuos) y cristalografía "macromolecular". La cristalografía de moléculas pequeñas generalmente involucra cristales con menos de 100 átomos en su unidad asimétrica; tales estructuras cristalinas suelen estar tan bien resueltas que los átomos se pueden discernir como "manchas" aisladas de densidad electrónica. Por el contrario, la cristalografía macromoleculara menudo involucra decenas de miles de átomos en la celda unitaria. Tales estructuras cristalinas generalmente están menos resueltas (más "difuminadas"); los átomos y los enlaces químicos aparecen como tubos de densidad electrónica, en lugar de átomos aislados. En general, las moléculas pequeñas también son más fáciles de cristalizar que las macromoléculas; sin embargo, la cristalografía de rayos X ha demostrado ser posible incluso para virus y proteínas con cientos de miles de átomos, a través de tecnología e imágenes cristalográficas mejoradas. Aunque normalmente la cristalografía de rayos X solo se puede realizar si la muestra está en forma de cristal, se han realizado nuevas investigaciones para muestrear formas de muestras no cristalinas.

Cristalización

Aunque la cristalografía se puede utilizar para caracterizar el desorden en un cristal impuro o irregular, la cristalografía generalmente requiere un cristal puro de alta regularidad para resolver la estructura de una disposición complicada de átomos. A veces se pueden obtener cristales puros y regulares a partir de materiales naturales o sintéticos, como muestras de metales, minerales u otros materiales macroscópicos. La regularidad de tales cristales a veces se puede mejorar con recocido de cristales macromoleculares y otros métodos. Sin embargo, en muchos casos, obtener un cristal con calidad de difracción es la principal barrera para resolver su estructura de resolución atómica.

La cristalografía de moléculas pequeñas y macromolecular difiere en el rango de posibles técnicas utilizadas para producir cristales con calidad de difracción. Las moléculas pequeñas generalmente tienen pocos grados de libertad conformacional y pueden cristalizarse mediante una amplia gama de métodos, como la deposición química de vapor y la recristalización. Por el contrario, las macromoléculas generalmente tienen muchos grados de libertad y su cristalización debe llevarse a cabo para mantener una estructura estable. Por ejemplo, las proteínas y las moléculas de ARN más grandes no pueden cristalizarse si se ha desplegado su estructura terciaria; por lo tanto, el rango de condiciones de cristalización se restringe a las condiciones de solución en las que dichas moléculas permanecen plegadas.

Los cristales de proteína casi siempre se cultivan en solución. El enfoque más común es reducir la solubilidad de las moléculas que lo componen muy gradualmente; si esto se hace demasiado rápido, las moléculas se precipitarán de la solución, formando un polvo inútil o un gel amorfo en el fondo del recipiente. El crecimiento de cristales en solución se caracteriza por dos pasos: la nucleación de un cristalito microscópico (que posiblemente tenga solo 100 moléculas), seguido del crecimiento de ese cristalito, idealmente a un cristal con calidad de difracción.Las condiciones de solución que favorecen el primer paso (nucleación) no siempre son las mismas condiciones que favorecen el segundo paso (crecimiento posterior). El objetivo del cristalógrafo es identificar las condiciones de la solución que favorecen el desarrollo de un solo cristal grande, ya que los cristales más grandes ofrecen una mejor resolución de la molécula. En consecuencia, las condiciones de la solución deberían desfavorecer el primer paso (nucleación) pero favorecerel segundo (crecimiento), de modo que solo se forma un cristal grande por gota. Si se favorece demasiado la nucleación, se formará una lluvia de pequeños cristalitos en la gota, en lugar de un cristal grande; si se favorece muy poco, no se formará cristal alguno. Otros enfoques implican la cristalización de proteínas bajo aceite, donde las soluciones acuosas de proteínas se dispensan bajo aceite líquido y el agua se evapora a través de la capa de aceite. Diferentes aceites tienen diferentes permeabilidades de evaporación, por lo tanto, producen cambios en las tasas de concentración de diferentes mezclas de percipientes/proteínas.

Es extremadamente difícil predecir buenas condiciones para la nucleación o el crecimiento de cristales bien ordenados. En la práctica, las condiciones favorables se identifican mediante selección; se prepara un lote muy grande de moléculas y se prueba una amplia variedad de soluciones de cristalización.Generalmente se prueban cientos, incluso miles, de condiciones de solución antes de encontrar la exitosa. Las diversas condiciones pueden utilizar uno o más mecanismos físicos para disminuir la solubilidad de la molécula; por ejemplo, algunos pueden cambiar el pH, algunos contienen sales de la serie de Hofmeister o sustancias químicas que reducen la constante dieléctrica de la solución y otros contienen polímeros grandes como el polietilenglicol que expulsan a la molécula de la solución por efectos entrópicos. También es común probar varias temperaturas para favorecer la cristalización, o bajar gradualmente la temperatura para que la solución se sobresature. Estos métodos requieren grandes cantidades de la molécula diana, ya que utilizan una alta concentración de la(s) molécula(s) a cristalizar. Debido a la dificultad de obtener cantidades tan grandes (miligramos) de proteína de grado de cristalización, se han desarrollado robots que son capaces de dispensar con precisión gotas de prueba de cristalización del orden de 100 nanolitros en volumen. Esto significa que se utiliza 10 veces menos proteína por experimento en comparación con los ensayos de cristalización realizados a mano (del orden de 1 microlitro).

Se conocen varios factores que inhiben o estropean la cristalización. Los cristales en crecimiento generalmente se mantienen a una temperatura constante y se protegen de golpes o vibraciones que puedan perturbar su cristalización. Las impurezas en las moléculas o en las soluciones de cristalización a menudo son enemigas de la cristalización. La flexibilidad conformacional en la molécula también tiende a hacer menos probable la cristalización, debido a la entropía. Las moléculas que tienden a autoensamblarse en hélices regulares a menudo no están dispuestas a ensamblarse en cristales.Los cristales pueden estropearse por maclas, lo que puede ocurrir cuando una celda unitaria puede empaquetarse igualmente favorablemente en múltiples orientaciones; aunque los avances recientes en métodos computacionales pueden permitir resolver la estructura de algunos cristales maclados. Habiendo fallado en cristalizar una molécula objetivo, un cristalógrafo puede volver a intentarlo con una versión ligeramente modificada de la molécula; incluso pequeños cambios en las propiedades moleculares pueden dar lugar a grandes diferencias en el comportamiento de cristalización.

Recopilación de datos

Montaje del cristal

El cristal se monta para las mediciones de modo que pueda mantenerse en el haz de rayos X y girarse. Hay varios métodos de montaje. En el pasado, los cristales se cargaban en capilares de vidrio con la solución de cristalización (las aguas madres). Hoy en día, los cristales de moléculas pequeñas generalmente se unen con aceite o pegamento a una fibra de vidrio o un bucle, que está hecho de nailon o plástico y se une a una varilla sólida. Los cristales de proteína se recogen con un asa y luego se congelan instantáneamente con nitrógeno líquido. Esta congelación reduce el daño por radiación de los rayos X, así como el ruido en los picos de Bragg debido al movimiento térmico (el efecto Debye-Waller). Sin embargo, los cristales de proteína no tratados a menudo se agrietan si se congelan instantáneamente; por lo tanto, generalmente se remojan previamente en una solución crioprotectora antes de congelarlos.Desafortunadamente, este remojo previo puede causar que el cristal se agriete, arruinándolo para la cristalografía. Generalmente, las condiciones criogénicas exitosas se identifican mediante prueba y error.

El capilar o bucle se monta en un goniómetro, lo que permite colocarlo con precisión dentro del haz de rayos X y rotarlo. Dado que tanto el cristal como el haz suelen ser muy pequeños, el cristal debe estar centrado dentro del haz con una precisión de ~25 micrómetros, lo que es ayudado por una cámara enfocada en el cristal. El tipo de goniómetro más común es el "goniómetro kappa", que ofrece tres ángulos de rotación: el ángulo ω, que gira sobre un eje perpendicular al haz; el ángulo κ, alrededor de un eje a ~50° del eje ω; y, finalmente, el ángulo φ sobre el eje del bucle/capilar. Cuando el ángulo κ es cero, los ejes ω y φ están alineados. La rotación κ permite un montaje conveniente del cristal, ya que el brazo en el que se monta el cristal se puede girar hacia el cristalógrafo. Las oscilaciones realizadas durante la recopilación de datos (mencionadas a continuación) involucran solo el eje ω. Un tipo más antiguo de goniómetro es el goniómetro de cuatro círculos y sus parientes, como el goniómetro de seis círculos.

Fuentes de rayos x

ánodo giratorio

La cristalografía a pequeña escala se puede realizar con una fuente de tubo de rayos X local, normalmente acoplada con un detector de placa de imagen. Estos tienen la ventaja de ser relativamente económicos y fáciles de mantener, y permiten una detección y recolección de muestras rápidas. Sin embargo, la longitud de onda de la luz producida está limitada por la disponibilidad de diferentes materiales de ánodo. Además, la intensidad está limitada por la potencia aplicada y la capacidad de enfriamiento disponible para evitar la fusión del ánodo. En tales sistemas, los electrones se evaporan de un cátodo y se aceleran a través de un fuerte potencial eléctrico de ~50 kV; habiendo alcanzado una alta velocidad, los electrones chocan con una placa de metal, emitiendo bremsstrahlungy algunas líneas espectrales fuertes correspondientes a la excitación de los electrones de la capa interna del metal. El metal más comúnmente utilizado es el cobre, que se puede mantener frío fácilmente debido a su alta conductividad térmica y que produce fuertes líneas K _α y K _β. La línea K _β a veces se suprime con una lámina de níquel delgada (~ 10 µm). La variedad más sencilla y barata de tubo de rayos X sellado tiene un ánodo estacionario (el tubo de Crookes) y funciona con ~2 kW de potencia de haz de electrones. La variedad más costosa tiene una fuente de tipo de ánodo giratorio que funciona con ~14 kW de potencia de haz de electrones.

Los rayos X generalmente se filtran (mediante el uso de filtros de rayos X) a una sola longitud de onda (monocromática) y se coliman en una sola dirección antes de que puedan golpear el cristal. El filtrado no solo simplifica el análisis de datos, sino que también elimina la radiación que degrada el cristal sin aportar información útil. La colimación se realiza con un colimador (básicamente, un tubo largo) o con una disposición inteligente de espejos suavemente curvados. Se prefieren los sistemas de espejos para cristales pequeños (menos de 0,3 mm) o con celdas unitarias grandes (más de 150 Å).

Joanna (Joka) Maria Vandenberg utilizó ánodos rotatorios en los primeros experimentos que demostraron el poder de los rayos X para la detección rápida (en producción en tiempo real) de grandes obleas de película delgada de InGaAsP para el control de calidad de los láseres de pozo cuántico.

Tubo de microfoco

Un desarrollo más reciente es el tubo de microfoco, que puede entregar un flujo de haz al menos tan alto (después de la colimación) como las fuentes de ánodo giratorio, pero solo requiere una potencia de haz de unas pocas decenas o cientos de vatios en lugar de requerir varios kilovatios.

Radiación sincrotrón

Las fuentes de radiación de sincrotrón son algunas de las fuentes de luz más brillantes de la Tierra y son algunas de las herramientas más poderosas disponibles para los cristalógrafos de rayos X. Haces de rayos X generados en grandes máquinas llamadas sincrotrones que aceleran partículas cargadas eléctricamente, a menudo electrones, casi a la velocidad de la luz y las confinan en un bucle (aproximadamente) circular usando campos magnéticos.

Los sincrotrones son generalmente instalaciones nacionales, cada una con varias líneas de luz dedicadas donde los datos se recopilan sin interrupción. Los sincrotrones fueron diseñados originalmente para ser utilizados por físicos de alta energía que estudian partículas subatómicas y fenómenos cósmicos. El componente más grande de cada sincrotrón es su anillo de almacenamiento de electrones. Este anillo en realidad no es un círculo perfecto, sino un polígono de muchos lados. En cada esquina del polígono, o sector, imanes alineados con precisión desvían la corriente de electrones. A medida que se desvía la trayectoria de los electrones, emiten ráfagas de energía en forma de rayos X.

El uso de radiación de sincrotrón tiene con frecuencia requisitos específicos para la cristalografía de rayos X. La intensa radiación ionizante puede causar daño por radiación a las muestras, particularmente a los cristales macromoleculares. La criocristalografía protege la muestra del daño por radiación al congelar el cristal a temperaturas de nitrógeno líquido (~100 K).. Los métodos de criocristalografía también se aplican a las fuentes de ánodo rotatorio de origen doméstico. Sin embargo, la radiación de sincrotrón tiene con frecuencia la ventaja de las longitudes de onda seleccionables por el usuario, lo que permite experimentos de dispersión anómala que maximizan la señal anómala. Esto es fundamental en experimentos como la dispersión anómala de longitud de onda única (SAD) y la dispersión anómala de longitud de onda múltiple (MAD).

Láser de electrones libres

Los láseres de electrones libres se han desarrollado para su uso en cristalografía de rayos X. Estas son las fuentes de rayos X más brillantes actualmente disponibles; con los rayos X llegando en ráfagas de femtosegundos. La intensidad de la fuente es tal que los patrones de difracción de resolución atómica se pueden resolver para cristales que de otro modo serían demasiado pequeños para la recolección. Sin embargo, la fuente de luz intensa también destruye la muestra, lo que requiere que se disparen múltiples cristales. Como cada cristal se orienta aleatoriamente en el haz, se deben recopilar cientos de miles de imágenes de difracción individuales para obtener un conjunto de datos completo. Este método, cristalografía en serie de femtosegundos, se ha utilizado para resolver la estructura de una serie de estructuras cristalinas de proteínas, a veces observando diferencias con estructuras equivalentes recopiladas de fuentes de sincrotrón.

Grabando los reflejos

Cuando un cristal se monta y se expone a un haz intenso de rayos X, dispersa los rayos X en un patrón de manchas o reflejos.que se puede observar en una pantalla detrás del cristal. Se puede ver un patrón similar apuntando con un puntero láser a un disco compacto. Las intensidades relativas de estos puntos proporcionan la información para determinar la disposición de las moléculas dentro del cristal en detalle atómico. Las intensidades de estos reflejos se pueden registrar con una película fotográfica, un detector de área (como un detector de píxeles) o con un sensor de imagen de dispositivo de carga acoplada (CCD). Los picos en ángulos pequeños corresponden a datos de baja resolución, mientras que los de ángulos altos representan datos de alta resolución; por lo tanto, se puede determinar un límite superior en la resolución final de la estructura a partir de las primeras imágenes. En este punto se pueden determinar algunas medidas de la calidad de la difracción, como la mosaicidad del cristal y su desorden general, como se observa en los anchos de los picos.

Una imagen de manchas es insuficiente para reconstruir todo el cristal; representa solo una pequeña porción de la transformada de Fourier completa. Para recopilar toda la información necesaria, el cristal debe girarse paso a paso 180°, con una imagen registrada en cada paso; en realidad, se requiere un poco más de 180° para cubrir el espacio recíproco, debido a la curvatura de la esfera de Ewald. Sin embargo, si el cristal tiene una simetría más alta, se puede registrar un rango angular más pequeño, como 90° o 45°. El eje de rotación debe cambiarse al menos una vez, para evitar que se desarrolle un "punto ciego" en el espacio recíproco cercano al eje de rotación. Se acostumbra mover el cristal ligeramente (de 0,5 a 2°) para capturar una región más amplia de espacio recíproco.

Pueden ser necesarios múltiples conjuntos de datos para ciertos métodos de eliminación gradual. Por ejemplo, la fase de dispersión anómala de múltiples longitudes de onda requiere que la dispersión se registre en al menos tres (y generalmente cuatro, por redundancia) longitudes de onda de la radiación de rayos X entrante. Un solo cristal puede degradarse demasiado durante la recopilación de un conjunto de datos, debido al daño por radiación; en tales casos, se deben tomar conjuntos de datos en múltiples cristales.

Análisis de los datos

Simetría cristalina, celda unitaria y escala de imagen

La serie registrada de patrones de difracción bidimensionales, cada uno correspondiente a una orientación diferente del cristal, se convierte en un modelo tridimensional de la densidad electrónica; la conversión utiliza la técnica matemática de las transformadas de Fourier, que se explica a continuación. Cada mancha corresponde a un tipo diferente de variación en la densidad electrónica; el cristalógrafo debe determinar qué variación corresponde a qué punto (indexación), las fuerzas relativas de los puntos en diferentes imágenes (fusión y escala) y cómo se deben combinar las variaciones para producir la densidad electrónica total (fases).

El procesamiento de datos comienza con la indexación de los reflejos. Esto significa identificar las dimensiones de la celda unitaria y qué pico de imagen corresponde a qué posición en el espacio recíproco. Un subproducto de la indexación es determinar la simetría del cristal, es decir, su grupo espacial. Algunos grupos espaciales se pueden eliminar desde el principio. Por ejemplo, las simetrías de reflexión no se pueden observar en moléculas quirales; por lo tanto, solo se permiten 65 grupos espaciales de 230 posibles para moléculas de proteína que casi siempre son quirales. La indexación generalmente se logra mediante una rutina de indexación automática. Una vez asignada la simetría, los datos se integran. Esto convierte los cientos de imágenes que contienen los miles de reflejos en un solo archivo, que consiste en (como mínimo) registros del índice de Miller de cada reflejo y una intensidad para cada reflejo (en este estado, el archivo a menudo también incluye estimaciones de error). y medidas de parcialidad (qué parte de un reflejo dado se grabó en esa imagen)).

Un conjunto completo de datos puede consistir en cientos de imágenes separadas tomadas en diferentes orientaciones del cristal. El primer paso es fusionar y escalar estas diversas imágenes, es decir, identificar qué picos aparecen en dos o más imágenes (fusionar) y escalar las imágenes relativas para que tengan una escala de intensidad consistente. La optimización de la escala de intensidad es fundamental porque la intensidad relativa de los picos es la información clave a partir de la cual se determina la estructura. La técnica repetitiva de recopilación de datos cristalográficos y la alta simetría frecuente de los materiales cristalinos hacen que el difractómetro registre muchas reflexiones equivalentes a la simetría varias veces. Esto permite calcular el factor R relacionado con la simetría, un índice de confiabilidad basado en cuán similares son las intensidades medidas de los reflejos equivalentes a la simetría, evaluando así la calidad de los datos.

Fase inicial

Los datos recopilados de un experimento de difracción son una representación de espacio recíproco de la red cristalina. La posición de cada "punto" de difracción se rige por el tamaño y la forma de la celda unitaria y la simetría inherente dentro del cristal. Se registra la intensidad de cada 'punto' de difracción, y esta intensidad es proporcional al cuadrado de la amplitud del factor de estructura. El factor de estructura es un número complejo que contiene información relativa tanto a la amplitud como a la fase de una onda. Para obtener un mapa de densidad de electrones interpretable, tanto la amplitud como la fase deben ser conocidas (un mapa de densidad de electrones permite que un cristalógrafo construya un modelo inicial de la molécula). La fase no se puede registrar directamente durante un experimento de difracción: esto se conoce como el problema de la fase. Las estimaciones de la fase inicial se pueden obtener de varias maneras:

Fases ab initio o métodos directos: este suele ser el método de elección para moléculas pequeñas (<1000 átomos que no son de hidrógeno) y se ha utilizado con éxito para resolver los problemas de fase para proteínas pequeñas. Si la resolución de los datos es mejor que 1,4 Å (140 pm), se pueden utilizar métodos directos para obtener información de fase, explotando las relaciones de fase conocidas entre ciertos grupos de reflexiones.
Reemplazo molecular: si se conoce una estructura relacionada, se puede usar como modelo de búsqueda en el reemplazo molecular para determinar la orientación y la posición de las moléculas dentro de la celda unitaria. Las fases obtenidas de esta manera se pueden utilizar para generar mapas de densidad de electrones.
Dispersión anómala de rayos X (fases MAD o SAD): la longitud de onda de los rayos X puede escanearse más allá de un borde de absorciónde un átomo, que cambia la dispersión de una manera conocida. Al registrar conjuntos completos de reflejos en tres longitudes de onda diferentes (muy por debajo, muy por encima y en el medio del borde de absorción), se puede resolver la subestructura de los átomos que se difractan de manera anómala y, por lo tanto, la estructura de toda la molécula. El método más popular para incorporar átomos de dispersión anómalos en proteínas es expresar la proteína en un auxótrofo de metionina (un huésped incapaz de sintetizar metionina) en un medio rico en selenio-metionina, que contiene átomos de selenio. A continuación, se puede realizar un experimento de dispersión anómala de múltiples longitudes de onda (MAD) alrededor del borde de absorción, que luego debería arrojar la posición de cualquier residuo de metionina dentro de la proteína, proporcionando fases iniciales.
Métodos de átomos pesados (reemplazo isomorfo múltiple): si se pueden introducir átomos de metales densos en electrones en el cristal, se pueden usar métodos directos o métodos de espacio de Patterson para determinar su ubicación y obtener fases iniciales. Estos átomos pesados pueden introducirse empapando el cristal en una solución que contenga átomos pesados o mediante cocristalización (creciendo los cristales en presencia de un átomo pesado). Al igual que en la fase de dispersión anómala de múltiples longitudes de onda, los cambios en las amplitudes de dispersión pueden interpretarse para producir las fases. Aunque este es el método original por el cual se resolvieron las estructuras cristalinas de proteínas, ha sido reemplazado en gran medida por la dispersión anómala de múltiples longitudes de onda con seleniometionina.

Construcción de modelos y refinamiento de fases.

Habiendo obtenido las fases iniciales, se puede construir un modelo inicial. Las posiciones atómicas en el modelo y sus respectivos factores de Debye-Waller (o factores B, que representan el movimiento térmico del átomo) se pueden refinar para ajustarse a los datos de difracción observados, idealmente produciendo un mejor conjunto de fases. Luego se puede ajustar un nuevo modelo al nuevo mapa de densidad de electrones y se llevan a cabo rondas sucesivas de refinamiento. Este proceso iterativo continúa hasta que se maximiza la correlación entre los datos de difracción y el modelo. La concordancia se mide por un factor R definido como ${displaystyle R={frac {sum_{text{todas las reflexiones}}left|F_{text{obs}}-F_{text{calc}}right|}{sum_{ text{todas las reflexiones}}left|F_{text{obs}}right|}},}$

donde F es el factor de estructura. Un criterio de calidad similar es R _free, que se calcula a partir de un subconjunto (~10 %) de reflejos que no se incluyeron en el refinamiento de la estructura. Ambos factores R dependen de la resolución de los datos. Como regla general, R _libre debe ser aproximadamente la resolución en angstroms dividida por 10; por lo tanto, un conjunto de datos con una resolución de 2 Å debería producir un R _libre final ~ 0,2. Las características de los enlaces químicos, como la estereoquímica, los enlaces de hidrógeno y la distribución de las longitudes y los ángulos de los enlaces, son medidas complementarias de la calidad del modelo. El sesgo de fase es un problema grave en la construcción de modelos iterativos. Omitir mapasson una técnica común utilizada para verificar esto.

Puede que no sea posible observar cada átomo en la unidad asimétrica. En muchos casos, el desorden cristalográfico mancha el mapa de densidad de electrones. Los átomos que se dispersan débilmente, como el hidrógeno, son rutinariamente invisibles. También es posible que un solo átomo aparezca varias veces en un mapa de densidad de electrones, por ejemplo, si una cadena lateral de proteína tiene múltiples (<4) conformaciones permitidas. En otros casos, el cristalógrafo puede detectar que la estructura covalente deducida para la molécula era incorrecta o cambiada. Por ejemplo, las proteínas pueden escindirse o sufrir modificaciones posteriores a la traducción que no se detectaron antes de la cristalización.

Trastorno

Un desafío común en el refinamiento de estructuras cristalinas resulta del desorden cristalográfico. El desorden puede adoptar muchas formas, pero en general implica la coexistencia de dos o más especies o conformaciones. La falta de reconocimiento del trastorno da como resultado una interpretación defectuosa. Las trampas del modelado inadecuado del desorden se ilustran con la hipótesis descartada de la isomería de estiramiento de enlace. El desorden se modela con respecto a la población relativa de los componentes, a menudo sólo dos, y su identidad. En estructuras de moléculas grandes e iones, el solvente y los contraiones a menudo están desordenados.

Análisis de datos computacionales aplicados

El uso de métodos computacionales para el análisis de datos de difracción de rayos X en polvo ahora está generalizado. Por lo general, compara los datos experimentales con el difractograma simulado de una estructura modelo, teniendo en cuenta los parámetros instrumentales, y refina los parámetros estructurales o microestructurales del modelo utilizando un algoritmo de minimización basado en mínimos cuadrados. La mayoría de las herramientas disponibles que permiten la identificación de fases y el refinamiento estructural se basan en el método Rietveld, algunas de ellas son software libre y abierto como FullProf Suite, Jana2006, MAUD, Rietan, GSAS, etc. mientras que otras están disponibles bajo licencias comerciales como Diffrac. Suite TOPAS, Partido!,etc. La mayoría de estas herramientas también permiten el refinamiento de Le Bail (también conocido como coincidencia de perfiles), es decir, el refinamiento de los parámetros de la celda en función de las posiciones de los picos de Bragg y los perfiles de los picos, sin tener en cuenta la estructura cristalográfica en sí misma. Las herramientas más recientes permiten el refinamiento de datos estructurales y microestructurales, como el programa FAULTS incluido en FullProf Suite, que permite el refinamiento de estructuras con defectos planos (por ejemplo, fallas de apilamiento, maclas, intercrecimientos).

Deposición de la estructura

Una vez que se ha finalizado el modelo de la estructura de una molécula, a menudo se deposita en una base de datos cristalográfica como la base de datos estructural de Cambridge (para moléculas pequeñas), la base de datos de estructuras cristalinas inorgánicas (ICSD) (para compuestos inorgánicos) o el banco de datos de proteínas (para proteínas y, a veces, ácidos nucleicos). Muchas estructuras obtenidas en empresas comerciales privadas para cristalizar proteínas médicamente relevantes no se depositan en bases de datos cristalográficas públicas.

Teoría de la difracción

El objetivo principal de la cristalografía de rayos X es determinar la densidad de electrones f (r) en todo el cristal, donde r representa el vector de posición tridimensional dentro del cristal. Para ello, se utiliza la dispersión de rayos X para recoger datos sobre su transformada de Fourier F (q), que se invierte matemáticamente para obtener la densidad definida en el espacio real, mediante la fórmula ${displaystyle f(mathbf {r})={frac {1}{left(2pi right)^{3}}}int F(mathbf {q})e^{mathrm { i} mathbf {q} cdot mathbf {r} }mathrm {d} mathbf {q},}$

donde la integral se toma sobre todos los valores de q. El vector real tridimensional q representa un punto en el espacio recíproco, es decir, a una oscilación particular en la densidad electrónica cuando uno se mueve en la dirección en la que apunta q. La longitud de q corresponde a $2pi$ dividido por la longitud de onda de la oscilación. La fórmula correspondiente para una transformada de Fourier se utilizará a continuación ${displaystyle F(mathbf {q})=int f(mathbf {r})mathrm {e} ^{-mathrm {i} mathbf {q} cdot mathbf {r} }mathrm {d} mathbf {r},}$

donde la integral se suma sobre todos los valores posibles del vector de posición r dentro del cristal.

La transformada de Fourier F (q) es generalmente un número complejo y, por lo tanto, tiene una magnitud | F (q)| y una fase φ (q) relacionada por la ecuación ${displaystyle F(mathbf {q})=left|F(mathbf {q})right|mathrm {e} ^{mathrm {i} phi (mathbf {q})}.}$

Las intensidades de las reflexiones observadas en la difracción de rayos X nos dan las magnitudes | F (q)| pero no las fases φ (q). Para obtener las fases, se recopilan conjuntos completos de reflejos con alteraciones conocidas de la dispersión, ya sea modulando la longitud de onda más allá de un cierto borde de absorción o agregando átomos metálicos de fuerte dispersión (es decir, densos en electrones) como el mercurio. La combinación de las magnitudes y las fases produce la transformada de Fourier completa F (q), que puede invertirse para obtener la densidad electrónica f (r).

Los cristales a menudo se idealizan como perfectamente periódicos. En ese caso ideal, los átomos están posicionados en una red perfecta, la densidad electrónica es perfectamente periódica y la transformada de Fourier F (q) es cero excepto cuando q pertenece a la red recíproca (los llamados picos de Bragg). En realidad, sin embargo, los cristales no son perfectamente periódicos; los átomos vibran alrededor de su posición media y puede haber desordenes de varios tipos, tales como mosaicismo, dislocaciones, varios defectos puntuales y heterogeneidad en la conformación de las moléculas cristalizadas. Por lo tanto, los picos de Bragg tienen un ancho finito y puede haber una dispersión difusa significativa, un continuo de rayos X dispersos que caen entre los picos de Bragg.

Comprensión intuitiva por la ley de Bragg

Se puede obtener una comprensión intuitiva de la difracción de rayos X a partir del modelo de difracción de Bragg. En este modelo, una reflexión dada está asociada con un conjunto de láminas espaciadas uniformemente que atraviesan el cristal, generalmente pasando por los centros de los átomos de la red cristalina. La orientación de un conjunto particular de hojas se identifica por sus tres índices de Miller (h, k, l) y su espaciado se indica mediante d. William Lawrence Bragg propuso un modelo en el que los rayos X entrantes se dispersan especularmente (como un espejo) desde cada plano; a partir de esa suposición, los rayos X dispersados desde planos adyacentes se combinarán constructivamente (interferencia constructiva) cuando el ángulo θ entre el plano y los rayos X da como resultado una diferencia de longitud de trayectoria que es un múltiplo entero n de la longitud de onda de rayos X λ. ${displaystyle 2dsin theta =nlambda.}$

Se dice que una reflexión está indexada cuando sus índices de Miller (o, más correctamente, sus componentes vectoriales de red recíproca) se han identificado a partir de la longitud de onda conocida y el ángulo de dispersión 2θ. Tal indexación proporciona los parámetros de la celda unitaria, las longitudes y los ángulos de la celda unitaria, así como su grupo espacial. Sin embargo, dado que la ley de Bragg no interpreta las intensidades relativas de los reflejos, generalmente es inadecuada para resolver la disposición de los átomos dentro de la celda unitaria; para ello se debe realizar un método de transformada de Fourier.

Dispersión como transformada de Fourier

El haz de rayos X entrante tiene una polarización y debe representarse como una onda vectorial; sin embargo, por simplicidad, representémosla aquí como una onda escalar. También ignoramos la complicación de la dependencia temporal de la onda y solo nos concentramos en la dependencia espacial de la onda. Las ondas planas se pueden representar mediante un vector de onda k _en, por lo que la fuerza de la onda entrante en el tiempo t = 0 viene dada por ${displaystyle Amathrm {e} ^{mathrm {i} mathbf {k} _{mathrm {in} }cdot mathbf {r} }.}$

En la posición r dentro de la muestra, sea una densidad de dispersores f (r); estos dispersores deberían producir una onda esférica dispersa de amplitud proporcional a la amplitud local de la onda entrante multiplicada por el número de dispersores en un pequeño volumen dV alrededor de r ${displaystyle {text{amplitud de la onda dispersa}}=Amathrm {e} ^{mathrm {i} mathbf {k} cdot mathbf {r} }Sf(mathbf {r})mathrm {d} V,}$

donde S es la constante de proporcionalidad.

Considere la fracción de ondas dispersas que salen con un vector de onda saliente de k _out y golpean la pantalla en r _screen. Dado que no se pierde energía (dispersión elástica, no inelástica), las longitudes de onda son las mismas que las magnitudes de los vectores de onda | k _en |=| k _fuera |. Desde el momento en que el fotón se dispersa en r hasta que se absorbe en la _pantallar, el fotón sufre un cambio de fase ${displaystyle e^{imathbf {k}_{text{out}}cdot left(mathbf {r}_{text{pantalla}}-mathbf {r} right)}.}$

La radiación neta que llega a la _pantallar es la suma de todas las ondas dispersas por todo el cristal. ${displaystyle ASint mathrm {d} mathbf {r} f(mathbf {r})mathrm {e} ^{mathrm {i} mathbf {k}_{text{in}} cdot mathbf {r} }e^{imathbf {k} _ {text{out}}cdot left(mathbf {r}_{text{pantalla}}-mathbf {r} right)}=ASe^{imathbf {k} _ {text{out}}cdot mathbf {r}_{text{pantalla}}}int mathrm {d} mathbf {r} f(mathbf {r})mathrm {e} ^{mathrm {i} left(mathbf {k} _ {text{in}}-mathbf {k} _ {text{out}}right)cdotmathbf {r} },}$

que puede escribirse como una transformada de Fourier ${displaystyle ASmathrm {e} ^{mathrm {i} mathbf {k}_{text{out}}cdot mathbf {r}_{text{pantalla}}}int dmathbf {r} f(mathbf {r})mathrm {e} ^{-mathrm {i} mathbf {q} cdot mathbf {r} }=ASmathrm {e} ^{mathrm {i } mathbf {k} _{text{out}}cdot mathbf {r} _{text{pantalla}}}F(mathbf {q}),}$

donde q = k _sale – k _entra. La intensidad medida del reflejo será el cuadrado de esta amplitud. ${displaystyle A^{2}S^{2}left|F(mathbf {q})right|^{2}.}$

Compañeros de Friedel y Artemisa

Por cada reflejo correspondiente a un punto q en el espacio recíproco, hay otro reflejo de la misma intensidad en el punto opuesto - q. Este reflejo opuesto se conoce como el mate de Friedel del reflejo original. Esta simetría resulta del hecho matemático de que la densidad de electrones f (r) en una posición r es siempre un número real. Como se señaló anteriormente, f (r) es la transformada inversa de su transformada de Fourier F (q); sin embargo, tal transformada inversa es un número complejo en general. Para asegurar que f (r) es real, la transformada de Fourier F (q) debe ser tal que las parejas de Friedel F (− q) y F (q) sean conjugados complejos entre sí. Así, F (− q) tiene la misma magnitud que F (q) pero tienen la fase opuesta, es decir, φ (q) = − φ (q) ${displaystyle F(-mathbf {q})=left|F(-mathbf {q})right|mathrm {e} ^{mathrm {i} phi (-mathbf {q}) }=F^{*}(mathbf {q})=left|F(mathbf {q})right|mathrm {e} ^{-mathrm {i} phi (mathbf {q})}.}$

La igualdad de sus magnitudes hace que los mates de Friedel tengan la misma intensidad | F |. Esta simetría permite medir la transformada de Fourier completa desde sólo la mitad del espacio recíproco, por ejemplo, girando el cristal un poco más de 180° en lugar de una revolución completa de 360°. En cristales con simetría significativa, incluso más reflejos pueden tener la misma intensidad (mates de Bijvoet); en tales casos, puede ser necesario medir incluso menos del espacio recíproco. En casos favorables de alta simetría, a veces solo se requieren 90 ° o incluso solo 45 ° de datos para explorar completamente el espacio recíproco.

La restricción de Friedel-mate se puede derivar de la definición de la transformada inversa de Fourier ${displaystyle f(mathbf {r})=int {frac {dmathbf {q} }{left(2pi right)^{3}}}F(mathbf {q}) mathrm {e} ^{mathrm {i} mathbf {q} cdot mathbf {r} }=int {frac {dmathbf {q} }{left(2pi right)^{ 3}}}left|F(mathbf {q})right|mathrm {e} ^{mathrm {i} phi (mathbf {q})}mathrm {e} ^{mathrm { i} mathbf {q} cdot mathbf {r} }.}$

Dado que la fórmula de Euler establece que e = cos(x) + i sin(x), la transformada inversa de Fourier se puede separar en una suma de una parte puramente real y una parte puramente imaginaria ${displaystyle f(mathbf {r})=int {frac {dmathbf {q} }{left(2pi right)^{3}}}left|F(mathbf {q })right|mathrm {e} ^{mathrm {i} left(phi +mathbf {q} cdot mathbf {r} right)}=int {frac {dmathbf { q} }{left(2pi right)^{3}}}left|F(mathbf {q})right|cos left(phi +mathbf {q} cdot mathbf {r} right)+iint {frac {dmathbf {q} }{left(2pi right)^{3}}}left|F(mathbf {q})right |sin left(phi +mathbf {q} cdot mathbf {r} right)=I_{mathrm {cos} }+iI_{mathrm {sin} }.}$

La función f (r) es real si y sólo si la segunda integral I _sin es cero para todos los valores de r. A su vez, esto es cierto si y solo si se cumple la restricción anterior ${displaystyle I_{sin }=int {frac {dmathbf {q} }{left(2pi right)^{3}}}left|F(mathbf {q}) derecha|sin left(phi +mathbf {q} cdot mathbf {r} right)=int {frac {dmathbf {q} }{left(2pi right)^ {3}}}left|F(mathbf {-q})right|sin left(-phi -mathbf {q} cdot mathbf {r} right)=-I_{sin },}$

ya que _peco = − peco implica que peco ₌₀.

Esfera de ewald

Cada imagen de difracción de rayos X representa solo un corte, un corte esférico de espacio recíproco, como puede verse en la construcción de la esfera de Ewald. Tanto k _out como k _in tienen la misma longitud, debido a la dispersión elástica, ya que la longitud de onda no ha cambiado. Por lo tanto, pueden representarse como dos vectores radiales en una esfera en el espacio recíproco, que muestra los valores de q que se muestrean en una imagen de difracción dada. Dado que existe una ligera dispersión en las longitudes de onda entrantes del haz de rayos X entrante, los valores de| F (q)|puede medirse solo para qvectores situados entre las dos esferas correspondientes a esos radios. Por lo tanto, para obtener un conjunto completo de datos de transformada de Fourier, es necesario rotar el cristal un poco más de 180°, o a veces menos si hay suficiente simetría. No se necesita una rotación completa de 360 ° debido a una simetría intrínseca a las transformadas de Fourier de funciones reales (como la densidad electrónica), pero se necesita "un poco más" de 180 ° para cubrir todo el espacio recíproco dentro de una resolución dada debido a la curvatura de la esfera de Ewald. En la práctica, el cristal se balancea una pequeña cantidad (0,25 a 1 °) para incorporar reflejos cerca de los límites de las capas esféricas de Ewald.

Función de Patterson

Un resultado bien conocido de las transformadas de Fourier es el teorema de autocorrelación, que establece que la autocorrelación c (r) de una función f (r) $c(mathbf{r}) = int dmathbf{x} f(mathbf{x}) f(mathbf{x} + mathbf{r}) = int frac{dmathbf{q }}{left(2piright)^{3}} C(mathbf{q}) e^{imathbf{q}cdotmathbf{r}}$

tiene una transformada de Fourier C (q) que es la magnitud al cuadrado de F (q) ${displaystyle C(mathbf {q})=left|F(mathbf {q})right|^{2}.}$

Por lo tanto, la función de autocorrelación c (r) de la densidad de electrones (también conocida como función de Patterson) se puede calcular directamente a partir de las intensidades de reflexión, sin calcular las fases. En principio, esto podría usarse para determinar la estructura cristalina directamente; sin embargo, es difícil de realizar en la práctica. La función de autocorrelación corresponde a la distribución de vectores entre átomos en el cristal; por lo tanto, un cristal de N átomos en su celda unitaria puede tener N (N − 1) picos en su función de Patterson. Dados los errores inevitables en la medición de las intensidades y las dificultades matemáticas de reconstruir las posiciones atómicas a partir de los vectores interatómicos, esta técnica rara vez se usa para resolver estructuras, excepto para los cristales más simples.

Ventajas de un cristal

En principio, se podría determinar una estructura atómica aplicando dispersión de rayos X a muestras no cristalinas, incluso a una sola molécula. Sin embargo, los cristales ofrecen una señal mucho más fuerte debido a su periodicidad. Una muestra cristalina es por definición periódica; un cristal se compone de muchas celdas unitarias repetidas indefinidamente en tres direcciones independientes. Dichos sistemas periódicos tienen una transformada de Fourier que se concentra en puntos que se repiten periódicamente en el espacio recíproco conocidos como picos de Bragg; los picos de Bragg corresponden a los puntos de reflexión observados en la imagen de difracción. Dado que la amplitud de estos reflejos crece linealmente con el número N de dispersores, la intensidad observada de estos puntos debería crecer cuadráticamente, como N. En otras palabras, el uso de un cristal concentra la dispersión débil de las celdas unitarias individuales en un reflejo coherente mucho más potente que se puede observar por encima del ruido. Este es un ejemplo de interferencia constructiva.

En una muestra líquida, en polvo o amorfa, las moléculas dentro de esa muestra están en orientaciones aleatorias. Estas muestras tienen un espectro de Fourier continuo que distribuye uniformemente su amplitud, lo que reduce la intensidad de la señal medida, como se observa en SAXS. Más importante aún, la información de orientación se pierde. Aunque teóricamente es posible, es experimentalmente difícil obtener estructuras de resolución atómica de moléculas asimétricas complicadas a partir de tales datos promediados rotacionalmente. Un caso intermedio es la difracción de fibra en la que las subunidades se disponen periódicamente en al menos una dimensión.

Premios Nobel relacionados con la cristalografía de rayos X

esconderAño	Laureado	Premio	Razón fundamental
1914	Max Von Laue	Física	"Por su descubrimiento de la difracción de rayos X por cristales", un paso importante en el desarrollo de la espectroscopia de rayos X.
1915	Guillermo Henry Bragg	Física	"Por sus servicios en el análisis de estructura cristalina mediante rayos X"
William Lawrence Bragg
1962	Max F. Perutz	Química	"por sus estudios de las estructuras de las proteínas globulares"
Juan C. Kendrew
1962	james dewey watson	Medicamento	"Por sus descubrimientos sobre la estructura molecular de los ácidos nucleicos y su importancia para la transferencia de información en la materia viva"
Francis Harry Compton Crick
Maurice Hugh Frederick Wilkins
1964	dorothy hodgkin	Química	"Por sus determinaciones por técnicas de rayos X de las estructuras de importantes sustancias bioquímicas"
1972	stanford moore	Química	"Por su contribución a la comprensión de la conexión entre la estructura química y la actividad catalítica del centro activo de la molécula de ribonucleasa"
Guillermo H Stein
1976	William N. Peine de labios	Química	"Por sus estudios sobre la estructura de los boranos que iluminan los problemas de los enlaces químicos"
1985	Jerónimo Karle	Química	"Por sus destacados logros en el desarrollo de métodos directos para la determinación de estructuras cristalinas"
Herbert A. Hauptman
1988	johann deisenhofer	Química	"Por su determinación de la estructura tridimensional de un centro de reacción fotosintético"
michel hartmut	Química
roberto huber	Química
1997	Juan E. Walker	Química	"Por su aclaración del mecanismo enzimático subyacente a la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP)"
2003	Roderick Mackinnon	Química	"Por descubrimientos relacionados con canales en membranas celulares [...] para estudios estructurales y mecánicos de canales iónicos"
Peter Agre	"Para descubrimientos sobre canales en las membranas celulares [...] para el descubrimiento de canales de agua"
2006	Roger D Kornberg	Química	"Por sus estudios de las bases moleculares de la transcripción eucariótica"
2009	Ada E. Yonath	Química	"Para estudios de la estructura y función del ribosoma"
Tomas A. Steitz
Venkatraman Ramakrishnan
2012	Brian Cobilka	Química	"Para estudios de receptores acoplados a proteína G"

Aplicaciones

La difracción de rayos X tiene amplias y diversas aplicaciones en las ciencias químicas, bioquímicas, físicas, materiales y mineralógicas. Laue afirmó en 1937 que la técnica "ha ampliado el poder de observar estructuras diminutas diez mil veces más allá de lo que nos brinda el microscopio". La difracción de rayos X es análoga a un microscopio con resolución de nivel atómico que muestra los átomos y su distribución de electrones.

La difracción de rayos X, la difracción de electrones y la difracción de neutrones brindan información sobre la estructura de la materia, cristalina y no cristalina, a nivel atómico y molecular. Además, estos métodos pueden aplicarse en el estudio de las propiedades de todos los materiales, inorgánicos, orgánicos o biológicos. Debido a la importancia y variedad de aplicaciones de los estudios de difracción de cristales, se han otorgado muchos premios Nobel por tales estudios.

Identificación de drogas

La difracción de rayos X se ha utilizado para la identificación de antibióticos como: ocho betalactámicos (ampicilina sódica, penicilina G procaína, cefalexina, trihidrato de ampicilina, penicilina benzatínica, bencilpenicilina sódica, cefotaxima sódica, ceftriaxona sódica), tres tetraciclinas (doxiciclina clorhidrato, oxitetraciclina deshidratada, clorhidrato de tetraciclina) y dos antibióticos macrólidos (azitromicina, estolato de eritromicina). Cada uno de estos fármacos tiene un patrón único de difracción de rayos X (XRD) que hace posible su identificación.

Caracterización de nanomateriales, fibras textiles y polímeros

El examen forense de cualquier rastro de evidencia se basa en el principio de intercambio de Locard. Este establece que "cada contacto deja un rastro". En la práctica, aunque se haya producido una transferencia de material, puede ser imposible de detectar, porque la cantidad transferida es muy pequeña.

XRD ha demostrado su papel en el avance de la investigación de nanomateriales. Es una de las principales herramientas de caracterización y proporciona información sobre las propiedades estructurales de varios nanomateriales tanto en forma de polvo como de película delgada.

Las fibras textiles son una mezcla de sustancias cristalinas y amorfas. Por lo tanto, la medida del grado de cristalización proporciona datos útiles en la caracterización de fibras mediante difractometría de rayos X. Se ha informado que se utilizó la difracción de rayos X para identificar un depósito "cristalino" que se encontró en una silla. Se encontró que el depósito era amorfo, pero el patrón de difracción presente coincidía con el del polimetilmetacrilato. La espectrometría de masas de pirólisis identificó más tarde el depósito como polimetilcianoacrilona de los parámetros de cristal de Boin.

Investigación de huesos

El calentamiento o la quema de huesos provoca cambios reconocibles en el mineral óseo que se pueden detectar mediante técnicas XRD. Durante los primeros 15 minutos de calentamiento a 500 °C o más, los cristales óseos comenzaron a cambiar. A temperaturas más altas, el grosor y la forma de los cristales de los huesos parecen estabilizados, pero cuando las muestras se calentaron a una temperatura más baja o durante un período más corto, las trazas de XRD mostraron cambios extremos en los parámetros del cristal.

Circuitos integrados

Se ha demostrado que la difracción de rayos X es un método para investigar la estructura compleja de los circuitos integrados.