Cósmido

Un cósmido es un tipo de plásmido híbrido que contiene una secuencia del fago Lambda cos. A menudo se utilizan como vector de clonación en ingeniería genética. Los cósmidos se pueden utilizar para construir bibliotecas genómicas. Fueron descritos por primera vez por Collins y Hohn en 1978. Los cósmidos pueden contener de 37 a 52 (normalmente 45) kb de ADN, límites basados en el tamaño normal del paquete de bacteriófagos. Pueden replicarse como plásmidos si tienen un origen de replicación (ori) adecuado: por ejemplo, ori SV40 en células de mamíferos, ori ColE1 para la replicación de ADN bicatenario o ori f1 para la replicación de ADN monocatenario en procariotas. Con frecuencia también contienen un gen para la selección, como la resistencia a los antibióticos, de modo que las células transformadas puedan identificarse sembrando en placas en un medio que contenga el antibiótico. Aquellas células que no absorbieran el cósmido no podrían crecer.

A diferencia de los plásmidos, también se pueden empaquetar in vitro en cápsides de fagos, un paso que requiere extremos cohesivos, también conocidos como sitios cos y que también se utilizan en la clonación con una lambda. fago como vector, sin embargo, casi todos los genes lambda han sido eliminados con la excepción de la secuencia cos. El ADN cósmido híbrido de las cápsidas puede luego transferirse a células bacterianas mediante transducción. Dado que existe un requisito para el empaquetado in vitro por el cual se requieren al menos 38 kb de ADN entre los sitios cos, el vector sin ADN insertado no se empaquetará (la inestabilidad de los plásmidos aumenta si el nuevo ADN insertado contiene muchas repeticiones directas o palindrómicas (invertidas). repeticiones) ADN. Esta inestabilidad se puede contrarrestar en gran medida mediante el uso de una bacteria huésped con mutaciones específicas que afectan la recombinación del ADN (N.B. La ausencia de repeticiones invertidas se observó en la primera publicación de Hohn & Collins citada anteriormente; ver también).

Secuencias porque

Cos secuencias son ~200 pares base largos y esenciales para el embalaje. Contienen un CosN sitio donde el ADN está cortado en cada hebra, 12 bp aparte, por terminada. Esto causa linearización de la circular acogedora con dos "cohesivos" o "puntos pegajosos" de 12bp. (El ADN debe ser lineal para encajar en una cabeza de phage.) El CosB sitio tiene la terminación mientras que está abriendo y separando los hilos. El cosQ sitio de siguiente cosmid (como la replicación del círculo rodante a menudo resulta en concatemeros lineales) se mantiene por el final después de que el anterior cosmid ha sido empaquetado, para prevenir la degradación por DNases celulares.

Características y usos de Cosmid

Los cosmos son predominantemente plasmidos con bacterias oriV, un marcador de selección de antibióticos y un sitio de clonación, pero llevan uno, o más recientemente dos, cos sitios derivados de lambda de bacteriófago. Dependiendo del objetivo particular del experimento, amplio rango de hospedaje cosmids, transbordador cosmids o 'mammalian' cosmids (enlazado a los marcadores de selección SV40 oriV y mamíferos) están disponibles. La capacidad de carga de los cosmides varía dependiendo del tamaño del vector en sí, pero generalmente se encuentra alrededor de 40–45 kb. El procedimiento de clonación implica la generación de dos brazos vectoriales que luego se unen al ADN extranjero. La selección contra el tipo silvestre cosmid DNA se hace simplemente mediante la exclusión de tamaño. Cosmids, por lo tanto, siempre forman colonias y no placas. También la densidad de clones es mucho menor con alrededor de 10⁵ – 10⁶ CFU por μg de ADN ligado.

Después de la construcción de bibliotecas de cósmidos o lambda recombinantes, el ADN total se transfiere a un E. coli mediante una técnica llamada envasado in vitro. Los extractos de embalaje necesarios se derivan de E. coli lisógenos cI857 (red-gam-Sam y Dam (conjunto de cabeza) y Eam (conjunto de cola) respectivamente). Estos extractos reconocerán y empaquetarán las moléculas recombinantes in vitro, generando partículas de fagos maduros (vectores basados en lambda) o plásmidos recombinantes contenidos en cubiertas de fagos (cósmidos). Estas diferencias se reflejan en las diferentes frecuencias de infección observadas a favor de los vectores de reemplazo lambda. Esto compensa su capacidad de carga ligeramente menor. Las bibliotecas de fagos también se almacenan y analizan más fácilmente que las bibliotecas de cósmidos.

ADN objetivo: el ADN genómico que se va a clonar debe cortarse en fragmentos de restricción del rango de tamaño adecuado. Esto generalmente se hace mediante restricción parcial seguida de fraccionamiento por tamaño o desfosforilación (usando fosfatasa del intestino de ternera) para evitar la codificación cromosómica, es decir, la ligadura de fragmentos físicamente no unidos.

Ejemplos de vectores cósmidos

Los vectores más utilizados incluyen "SuperCos 1"