Coomassie azul brillante
Azul brillante de Coomassie es el nombre de dos tintes de trifenilmetano similares que se desarrollaron para su uso en la industria textil pero que ahora se usan comúnmente para teñir proteínas en bioquímica analítica. El azul brillante Coomassie G-250 se diferencia del azul brillante Coomassie R-250 por la adición de dos grupos metilo. El nombre "Coomassie" es una marca registrada de Imperial Chemical Industries.
Nombre y descubrimiento
El nombre Coomassie fue adoptado a finales del siglo XIX como nombre comercial por el fabricante de tintes Levinstein Ltd, con sede en Blackley, para comercializar una gama de tintes ácidos para lana. En 1896, durante la Cuarta Guerra Anglo-Ashanti, las fuerzas británicas ocuparon la ciudad de Coomassie (la actual Kumasi en Ghana). En 1918, Levinstein Ltd pasó a formar parte de British Dyestuffs, que en 1926 pasó a formar parte de Imperial Chemical Industries. Aunque ICI todavía posee la marca Coomassie, la empresa ya no fabrica los tintes.
Los tintes azules de trifenilmetano disulfonados fueron producidos por primera vez en 1913 por Max Weiler, que tenía su sede en Elberfeld, Alemania. Posteriormente se obtuvieron varias patentes sobre la síntesis orgánica.
Los artículos publicados en revistas de bioquímica con frecuencia se refieren a estos tintes simplemente como "Coomassie" sin especificar qué tinte se utilizó. De hecho, el Índice de colores enumera más de 40 tintes con el color "Coomassie" en su nombre. También hay otros Coomassie "azul" tintes. Por ejemplo, el índice Merck (décima edición) enumera Coomassie Blue RL (Acid Blue 92, C.I. 13390), que tiene una estructura completamente diferente.
Color tinte
El sufijo "R" en el nombre de Coomassie, el azul brillante R-250 es una abreviatura de "rojo" ya que el color azul del tinte tiene un ligero tinte rojizo. Para el "G" variante el color azul tiene un tinte más verdoso. El "250" Originalmente denotaba la pureza del tinte.
El color de los dos tintes depende de la acidez de la solución. La "G" La forma del tinte ha sido estudiada en detalle. A un pH inferior a 0 el tinte tiene un color rojo con un máximo de absorción a una longitud de onda de 465 nm. A un pH de alrededor de 1, el tinte es verde con un máximo de absorción a 620 nm, mientras que por encima de pH 2 el tinte es azul brillante con un máximo a 595 nm. A pH 7, el tinte tiene un coeficiente de extinción de 43.000 M−1 cm−1.
Los diferentes colores son el resultado de los diferentes estados cargados de la molécula de tinte. En la forma roja, los tres átomos de nitrógeno tienen carga positiva. Los dos grupos de ácido sulfónico tienen un pKa extremadamente bajo y normalmente estarán cargados negativamente, por lo que a un pH cercano a cero el colorante será un catión con una carga total de +1. El color verde corresponde a una forma del tinte sin carga global neta. En medios neutros (pH 7), sólo el átomo de nitrógeno del resto de difenilamina lleva una carga positiva y la molécula de tinte azul es un anión con una carga total de -1. Los valores pKa para las pérdidas de los dos protones son 1,15 y 1,82, respectivamente. El protón final se pierde en condiciones alcalinas y el tinte se vuelve rosa (pKa 12,4).
El tinte interactúa electrostáticamente pero de forma no covalente con los grupos amino y carboxilo de las proteínas. Las moléculas de tinte se unen a proteínas, incluidas las de la lana (queratina), para formar un complejo proteína-tinte. La formación del complejo estabiliza la forma aniónica cargada negativamente del tinte, produciendo el color azul, incluso en condiciones ácidas cuando la mayoría de las moléculas en solución están en forma catiónica. Ésta es la base del ensayo de Bradford, que cuantifica la proteína mediante la unión del colorante azul brillante de Coomassie. La unión del tinte a una proteína provoca un cambio en el máximo de absorbancia del tinte de 465 a 595 nm. Se controla el aumento de la absorción a 595 nm para determinar la concentración de proteínas.
El tinte también forma un complejo con el detergente aniónico dodecilsulfato de sodio (SDS). La formación de este complejo estabiliza la forma verde neutra del tinte. Este efecto puede interferir con la estimación de la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford. También es probable que el detergente aniónico compita con el colorante por unirse a la proteína.
Aplicaciones en bioquímica
El azul brillante Coomassie R-250 fue utilizado por primera vez para visualizar proteínas en 1963 por Fazekas de St. Groth y sus colegas. Las muestras de proteínas se separaron electroforéticamente sobre una lámina de acetato de celulosa. Luego, la lámina se empapó en ácido sulfosalicílico para fijar las bandas de proteínas y se transfirió a una solución del tinte.
Dos años más tarde, en 1965, Meyer y Lambert utilizaron el azul brillante Coomassie R-250 para teñir muestras de proteínas después de la separación electroforética en un gel de poliacrilamida. Empaparon el gel en una solución colorante que contenía metanol, ácido acético y agua. A medida que el tinte tiñó el gel de poliacrilamida y la proteína, para visualizar las bandas de proteínas necesitaban decolorar el gel, lo que hicieron electroforéticamente. Publicaciones posteriores informaron que los geles de poliacrilamida se podían eliminar con éxito utilizando una solución de ácido acético.
El primer informe sobre el uso de la forma G del tinte para visualizar bandas de proteínas en geles de poliacrilamida se produjo en 1967, cuando el tinte se disolvió en una solución de ácido acético que contenía metanol. Posteriormente se descubrió que las bandas de proteínas podían teñirse sin teñir la poliacrilamida utilizando un coloide de la forma G del colorante en una solución de ácido tricloroacético que no contenía metanol. Con este procedimiento ya no fue necesario decolorar el gel. Las formulaciones modernas suelen utilizar un coloide de colorante en forma G en una solución que contiene ácido fosfórico, etanol (o metanol) y sulfato de amonio (o sulfato de aluminio).
El ensayo Bradford utiliza las propiedades espectrales de Coomassie brillante azul G-250 para estimar la cantidad de proteína en una solución. Una muestra de proteína se añade a una solución del tinte en ácido fósforo y etanol. Bajo las condiciones de ácido el tinte es normalmente un color marrón pero en unión a la proteína se produce la forma azul del tinte. La absorción óptica de la solución se mide a una longitud de onda de 595 nm. El tinte se observa por su alto nivel de sensibilidad: Se pueden detectar 5 μg de proteína. Sin embargo, entre las desventajas del método es su variabilidad de desarrollo de color con diferentes proteínas: el cambio de absorción por unidad de masa de proteínas varía con el tipo de la proteína.
Al unirse a una proteína, la molécula de tinte Coomassie azul brillante G-250 cargada negativamente le dará una carga negativa general a la proteína. Esta propiedad se puede utilizar para separar proteínas o complejos de proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes en una técnica llamada PAGE nativa azul. La movilidad del complejo en el gel de poliacrilamida dependerá tanto del tamaño del complejo proteico (es decir, el peso molecular) como de la cantidad de colorante unido a la proteína.
La tinción azul de Coomassie también se puede utilizar como un método de tinción de control de carga en el análisis de mancha occidental. Se aplica como una mancha anticuerpo aniónica.
Usos médicos
En 2009, brillante G azul fue utilizado en experimentos científicos para tratar lesiones espinal en ratas de laboratorio. Actúa reduciendo la respuesta de inflamación natural del cuerpo, lo que puede causar que las neuronas en la zona mueran de estrés metabólico. Pruebas en las ratas resultaron eficaces. En comparación con las ratas que no habían recibido el tinte, las ratas que fueron tratadas con el tinte realizaron mejor en las pruebas de movimiento. Se desconoce si este tratamiento se puede utilizar eficazmente en los seres humanos. Los experimentos animales administraron el tinte dentro de 15 minutos de lesión, pero para ser eficaz en un entorno de vida real, donde puede tomar tiempo para que un paciente llegue a la sala de emergencias, el tratamiento debe ser eficaz incluso cuando se administra hasta dos horas después de la lesión. El único efecto secundario reportado fue que las ratas se volvieron temporalmente azules.
Bajo los nombres comerciales ILM Blue y Brilliant Peel, el azul brillante G se utiliza como tinte para ayudar a los cirujanos en la cirugía de retina. En diciembre de 2019, se aprobó el uso del azul brillante G (bajo el nombre comercial TissueBlue, DORC International, Países Bajos) en humanos en los Estados Unidos.
Tissueblue fue aprobado para uso médico en Canadá en enero de 2021.
Aplicación en ciencia forense
La capacidad del tinte Coomassie para apuntar a aminoácidos con grupos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano) y cadenas laterales básicas (lisina, arginina e histidina) permite utilizar el ensayo de Bradford para el análisis de huellas dactilares. El ensayo se utilizó con éxito para identificar el sexo biológico de la huella dactilar. Se demostró que las muestras femeninas tenían una absorbancia mayor que las muestras masculinas cuando se analizaron con longitudes de onda similares. Esto proporciona un método más simple para el análisis de huellas dactilares al reducir la cantidad de aminoácidos que deben analizarse de 23 a 6 y requiere poca o ninguna preparación del ensayo, en contraste con el ensayo químico con ninhidrina, que requiere una preparación del ensayo como calentamiento y cascada de enzimas.