Centrifugación

Centrifugado de laboratorio

La centrifugación es un proceso mecánico que involucra el uso de la fuerza centrífuga para separar partículas de una solución según su tamaño, forma, densidad, viscosidad media y velocidad del rotor. Los componentes más densos de la mezcla se alejan del eje de la centrífuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla migran hacia el eje. Los químicos y biólogos pueden aumentar la fuerza gravitacional efectiva del tubo de ensayo para que el precipitado (pellet) viaje rápida y completamente hasta el fondo del tubo. El líquido restante que se encuentra sobre el precipitado se denomina sobrenadante o sobrenadante.

Existe una correlación entre el tamaño y la densidad de una partícula y la velocidad a la que la partícula se separa de una mezcla heterogénea, cuando la única fuerza aplicada es la de la gravedad. Cuanto mayor sea el tamaño y la densidad de las partículas, más rápido se separan de la mezcla. Al aplicar una fuerza gravitatoria efectiva mayor a la mezcla, como lo hace una centrífuga, se acelera la separación de las partículas. Esto es ideal en entornos industriales y de laboratorio porque las partículas que se separarían naturalmente durante un largo período de tiempo se pueden separar en mucho menos tiempo.

La velocidad de centrifugación se especifica mediante la velocidad angular, generalmente expresada como revoluciones por minuto (RPM), o la aceleración expresada como g. El factor de conversión entre RPM y g depende del radio del rotor de la centrífuga. Las partículas' la velocidad de sedimentación en la centrifugación es una función de su tamaño y forma, la aceleración centrífuga, la fracción de volumen de los sólidos presentes, la diferencia de densidad entre la partícula y el líquido, y la viscosidad. La aplicación más común es la separación de sólidos de suspensiones altamente concentradas, que se utiliza en el tratamiento de lodos de depuradora para deshidratación donde se producen sedimentos menos consistentes.

El método de centrifugación tiene una amplia variedad de aplicaciones industriales y de laboratorio; Este proceso no solo se utiliza para separar dos sustancias miscibles, sino también para analizar las propiedades hidrodinámicas de las macromoléculas. Es uno de los métodos de investigación más importantes y comúnmente utilizados en bioquímica, biología celular y molecular. En las industrias química y alimentaria, las centrífugas especiales pueden procesar un flujo continuo de partículas que se convierten en un líquido separado como el plasma. La centrifugación es también el método más común utilizado para el enriquecimiento de uranio, y se basa en la ligera diferencia de masa entre los átomos de U-238 y U-235 en el gas hexafluoruro de uranio.

Fórmula matemática

En una suspensión líquida, muchas partículas o células caerán gradualmente al fondo del recipiente debido a la gravedad; sin embargo, la cantidad de tiempo necesario para tales separaciones no es factible. Otras partículas, que son muy pequeñas, no pueden aislarse en solución hasta que se exponen a una fuerza centrífuga elevada. A medida que la suspensión gira a cierta velocidad o revoluciones por minuto (RPM), la fuerza centrífuga permite que las partículas viajen radialmente alejándose del eje de rotación. La fórmula general para calcular las revoluciones por minuto (RPM) de una centrífuga es:

RPM=gr{displaystyle RPM={sqrt {gover r}},

donde g representa la fuerza respectiva de la centrífuga y r el radio desde el centro del rotor hasta un punto en la muestra.

Sin embargo, dependiendo del modelo de centrifugado utilizado, el ángulo respectivo del rotor y el radio puede variar, por lo que la fórmula se modifica. Por ejemplo, el rotor Sorvall #SS-34 tiene un radio máximo de 10.8 cm, por lo que la fórmula se convierte en RPM=299gr{textstyle RPM=299{sqrt {gover r}}, que puede simplificar aún más RPM=91g{textstyle RPM=91{sqrt {g}.

En comparación con la gravedad, la fuerza de la partícula se denomina 'Fuerza centrífuga relativa' (FCR). Es la fuerza perpendicular ejercida sobre el contenido del rotor como consecuencia de la rotación, siempre relativa a la gravedad de la tierra, que mide la fuerza de rotores de diferentes tipos y tamaños. Por ejemplo, la RCF de 1000 x g significa que la fuerza centrífuga es 1000 veces más fuerte que la fuerza gravitatoria terrestre. RCF depende de la velocidad de rotación en rpm y la distancia de las partículas desde el centro de rotación. La fórmula más común utilizada para calcular RCF es:

RCF=1.118× × 10− − 5× × r× × ()rpm)2{displaystyle RCF=1.118times 10^{-5}times rtimes (rpm)^{2},

Donde 1.118× × 10− − 5{textstyle 1.118times 10^{-5} es una constante; r es el radio, expresado en centímetros, entre el eje de rotación y el centro; y rpm es la velocidad de las revoluciones por minuto.

Históricamente, se han realizado muchas separaciones a la velocidad de 3000 rpm; una guía áspera de la fuerza 'g' ejercida a esta velocidad es multiplicar el radio centrifugación por un factor de 10, por lo que un radio de 160 mm da aproximadamente 1600 x g. Este es un enfoque bastante arbitrario, ya que el RCF aplicado depende linealmente del radio, por lo que un radio de 10% más grande significa que un 10% más alto RCF se aplica a la misma velocidad. Roughly, la fórmula anterior se puede simplificar RCF=10× × r{textstyle RCF=10times r}, con un error de sólo 0,62%.

Centrifugación en investigación biológica

Microcentrífugas

Las microcentrífugas son modelos de sobremesa especialmente diseñados con rotores ligeros de pequeño volumen capaces de una aceleración muy rápida de hasta aproximadamente 17 000 rpm. Son dispositivos ligeros que se utilizan principalmente para la centrifugación breve de muestras hasta alrededor de 0,2–2,0 ml. Sin embargo, debido a su pequeña escala, son fácilmente transportables y, si es necesario, pueden funcionar en una cámara frigorífica. Pueden ser refrigerados o no. La microcentrífuga se usa normalmente en laboratorios de investigación en los que se requiere someter pequeñas muestras de moléculas biológicas, células o núcleos a RCF alto durante intervalos de tiempo relativamente cortos. Las microcentrífugas diseñadas para operar a alta velocidad pueden alcanzar hasta 35 000 rpm, lo que genera una RCF de hasta 30 000 ×g, y se denominan microcentrífugas de alta velocidad.

Centrífugas de baja velocidad

Las centrífugas de baja velocidad se utilizan para recolectar precipitados químicos, células intactas (animales, vegetales y algunos microorganismos), núcleos, cloroplastos, mitocondrias grandes y fragmentos de membranas plasmáticas más grandes. En estas centrífugas también se ejecutan gradientes de densidad para purificar células. Los rotores de cubeta basculante tienden a usarse mucho debido a la gran flexibilidad del tamaño de la muestra mediante el uso de adaptadores. Estas máquinas tienen velocidades de rotor máximas de menos de 10 000 rpm y varían desde pequeñas centrífugas de sobremesa hasta grandes centrífugas de pie.

Centrífugas de alta velocidad

Las centrífugas de alta velocidad se utilizan normalmente para recolectar microorganismos, virus, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas y membranas tubulares de Golgi intactas. La mayoría de las tareas de peletización simples se llevan a cabo en rotores de ángulo fijo. Algunos trabajos de gradiente de densidad para purificar células y orgánulos se pueden llevar a cabo en rotores de cubeta oscilante o, en el caso de los gradientes de Percoll, en rotores de ángulo fijo. Las centrífugas de alta velocidad o supervelocidad pueden manejar volúmenes de muestra más grandes, desde unas pocas decenas de mililitros hasta varios litros. Además, las centrífugas más grandes también pueden alcanzar velocidades angulares más altas (alrededor de 30 000 rpm). Los rotores pueden venir con diferentes adaptadores para contener varios tamaños de tubos de ensayo, botellas o placas de microtitulación.

Ultracentrifugaciones

La ultracentrifugación utiliza una gran fuerza centrífuga para estudiar las propiedades de las partículas biológicas a velocidades excepcionalmente altas. Las ultracentrífugas actuales pueden girar hasta 150 000 rpm (equivalente a 1 000 000 x g). Se utilizan para recolectar todas las vesículas de membrana derivadas de la membrana plasmática, el retículo endoplásmico (RE) y la membrana de Golgi, endosomas, ribosomas, subunidades ribosómicas, plásmidos, ADN, ARN y proteínas en rotores de ángulo fijo. En comparación con las microcentrífugas o las centrífugas de alta velocidad, las ultracentrífugas pueden aislar partículas mucho más pequeñas y, además, mientras que las microcentrífugas y las supercentrífugas separan partículas en lotes (los volúmenes limitados de muestras deben manipularse manualmente en tubos de ensayo o botellas), las ultracentrífugas pueden separar moléculas en lotes o sistemas de flujo continuo.

La ultracentrifugación se emplea para la separación de macromoléculas/estudios cinéticos de unión de ligandos, la separación de varias fracciones de lipoproteínas del plasma y la desprotonización de fluidos fisiológicos para el análisis de aminoácidos.

Son las centrífugas más utilizadas para la purificación en gradiente de densidad de todas las partículas excepto las células y, aunque tradicionalmente se han utilizado cubos oscilantes para este fin, también se utilizan rotores de ángulo fijo y rotores verticales, especialmente para la auto- Gradientes generados y puede mejorar la eficiencia de la separación en gran medida. Hay dos tipos de ultracentrífugas: la analítica y la preparativa.

Ultracentrifugación analítica

La ultracentrifugación analítica (AUC) se puede utilizar para determinar las propiedades de las macromoléculas, como la forma, la masa, la composición y la conformación. Es una técnica de análisis biomolecular de uso común para evaluar la pureza de la muestra, caracterizar los mecanismos de ensamblaje y desensamblaje de los complejos biomoleculares, determinar las estequiometrías de las subunidades, identificar y caracterizar los cambios conformacionales macromoleculares y calcular las constantes de equilibrio y los parámetros termodinámicos para la autoasociación. y sistemas de heteroasociación. Las ultracentrífugas analíticas incorporan un sistema de detección óptica basado en luz visible/ultravioleta para monitorear en tiempo real el progreso de la muestra durante un centrifugado.

Las muestras se centrifugan con una solución de alta densidad como sacarosa, cloruro de cesio o iodixanol. La solución de alta densidad puede tener una concentración uniforme en todo el tubo de ensayo ("cojín") o una concentración variable ("gradiente"). Las propiedades moleculares se pueden modelar mediante análisis de velocidad de sedimentación o análisis de equilibrio de sedimentación. Durante la ejecución, la partícula o las moléculas migrarán a través del tubo de ensayo a diferentes velocidades según sus propiedades físicas y las propiedades de la solución, y finalmente formarán un gránulo en el fondo del tubo o bandas a varias alturas.

Ultracentrifugación preparativa

Las ultracentrífugas preparativas se utilizan a menudo para separar partículas según sus densidades, aislar o recolectar partículas más densas para recolectarlas en el sedimento y clarificar suspensiones que contienen partículas. A veces, los investigadores también usan ultracentrífugas preparativas si necesitan flexibilidad para cambiar el tipo de rotor en el instrumento. Las ultracentrífugas preparativas se pueden equipar con una amplia gama de tipos de rotores diferentes, que pueden hacer girar muestras de diferente número, en diferentes ángulos y a diferentes velocidades.

Proceso de fraccionamiento

En la investigación biológica, el fraccionamiento celular normalmente incluye el aislamiento de los componentes celulares mientras conserva las funciones individuales de cada componente. Generalmente, la muestra de células se almacena en una suspensión que es:

• Buffered-neutral pH, previniendo daños a la estructura de proteínas incluyendo enzimas (que podrían afectar los vínculos iónicos)
• Isotónica (de igual potencial de agua) – esto evita la ganancia de agua o la pérdida por los organelles
• Cool—reducir la actividad general de la enzima liberada más adelante en el procedimiento

La centrifugación es el primer paso en la mayoría de los fraccionamientos. A través de la centrifugación a baja velocidad, se pueden eliminar los restos celulares, dejando un sobrenadante que conserva el contenido de la célula. La centrifugación repetida a velocidades progresivamente más altas fraccionará homogeneizados de células en sus componentes. En general, cuanto menor es el componente subcelular, mayor es la fuerza centrífuga necesaria para sedimentarlo. La fracción soluble de cualquier lisado puede luego separarse en sus constituyentes usando una variedad de métodos.

Centrífuga diferencial

La centrifugación diferencial es el método más simple de fraccionamiento por centrifugación, comúnmente utilizado para separar orgánulos y membranas que se encuentran en las células. Los orgánulos generalmente difieren entre sí en densidad y tamaño, lo que hace posible el uso de centrifugación diferencial y centrifugación en general. Luego, los orgánulos se pueden identificar mediante la prueba de indicadores que son exclusivos de los orgánulos específicos. La aplicación más utilizada de esta técnica es producir fracciones subcelulares crudas a partir de un tejido homogeneizado como el de hígado de rata. Las partículas de diferentes densidades o tamaños en una suspensión se sedimentan a diferentes velocidades, y las partículas más grandes y más densas se sedimentan más rápido. Estas tasas de sedimentación se pueden aumentar utilizando la fuerza centrífuga.

Una suspensión de células se somete a una serie de ciclos de fuerza centrífuga crecientes para producir una serie de gránulos que comprenden células con una tasa de sedimentación decreciente. El homogeneizado incluye núcleos, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, láminas de membrana plasmática y una amplia gama de vesículas derivadas de varios compartimentos de membrana intracelular y también de la membrana plasmática, normalmente en un medio tamponado.

Centrífuga en gradiente de densidad

Se sabe que la centrifugación en gradiente de densidad es uno de los métodos más eficientes para separar partículas suspendidas y se utiliza como técnica de separación y como método para medir la densidad de partículas o moléculas en una mezcla.

Se utiliza para separar partículas en función del tamaño, la forma y la densidad mediante el uso de un medio de densidades graduadas. Durante una centrifugación relativamente corta o lenta, las partículas se separan por tamaño y las partículas más grandes sedimentan más lejos que las más pequeñas. Durante una centrifugación larga o rápida, las partículas viajan a lugares en el gradiente donde la densidad del medio es la misma que la densidad de la partícula; (ρp – ρm) → 0. Por lo tanto, una partícula pequeña y densa sedimenta inicialmente con menos facilidad que una partícula grande y de baja densidad. Las partículas grandes alcanzan pronto su posición de densidad de equilibrio, mientras que las partículas pequeñas migran lentamente a través de la zona de partículas grandes y finalmente toman una posición de equilibrio más profunda en el gradiente.

Un tubo, después de ser centrifugado por este método, tiene partículas en orden de densidad según la altura. El objeto o partícula de interés residirá en la posición dentro del tubo correspondiente a su densidad. Sin embargo, todavía son posibles algunas sedimentaciones no ideales cuando se utiliza este método. El primer problema potencial es la agregación no deseada de partículas, pero esto puede ocurrir en cualquier centrifugación. La segunda posibilidad ocurre cuando sedimentan gotitas de solución que contienen partículas. Esto es más probable que ocurra cuando se trabaja con una solución que tiene una capa de suspensión flotando en un líquido denso, que de hecho tiene poco o ningún gradiente de densidad.

Otras aplicaciones

Se puede utilizar una centrífuga para aislar pequeñas cantidades de sólidos retenidos en suspensión de líquidos, como en la separación de polvo de tiza del agua. En la investigación biológica, se puede utilizar en la purificación de células de mamíferos, fraccionamiento de orgánulos subcelulares, fraccionamiento de vesículas de membrana, fraccionamiento de macromoléculas y complejos macromoleculares, etc. La centrifugación se utiliza de muchas maneras diferentes en la industria alimentaria. Por ejemplo, en la industria láctea, se suele utilizar en la clarificación y desnatado de la leche, extracción de nata, producción y recuperación de caseína, producción de queso, eliminación de contaminantes bacterianos, etc. Esta técnica de procesamiento también se utiliza en la producción de bebidas., zumos, café, té, cerveza, vino, leche de soja, procesamiento/recuperación de aceites y grasas, manteca de cacao, producción de azúcar, etc. También se utiliza en la clarificación y estabilización del vino.

En laboratorios forenses y de investigación, se puede utilizar en la separación de orina y componentes sanguíneos. También ayuda en la separación de proteínas utilizando técnicas de purificación como la sal, p. precipitación de sulfato de amonio. La centrifugación es también una técnica importante en el tratamiento de residuos, siendo uno de los procesos más comunes utilizados para la deshidratación de lodos. Este proceso también juega un papel en la separación ciclónica, donde las partículas se separan de un flujo de aire sin el uso de filtros. En un colector ciclónico, el aire se mueve en una trayectoria helicoidal. Las partículas con alta inercia son separadas por la fuerza centrífuga mientras que las partículas más pequeñas continúan con el flujo de aire.

Las centrífugas también se han utilizado en menor medida para aislar compuestos más ligeros que el agua, como el aceite. En tales situaciones, la descarga acuosa se obtiene en la salida opuesta de la cual los sólidos con una gravedad específica mayor que uno son las sustancias objetivo para la separación.

Historia

Para 1923, Theodor Svedberg y su estudiante H. Rinde habían analizado con éxito soles de grano grande en términos de su sedimentación gravitacional. Los soles consisten en una sustancia distribuida uniformemente en otra sustancia, también conocida como coloide. Sin embargo, los soles de grano más pequeño, como los que contienen oro, no pudieron analizarse. Para investigar este problema, Svedberg desarrolló una centrífuga analítica, equipada con un sistema de absorción fotográfica, que ejercería un efecto centrífugo mucho mayor. Además, desarrolló la teoría necesaria para medir el peso molecular. Durante este tiempo, la atención de Svedberg pasó del oro a las proteínas.

Hacia 1900, se aceptaba generalmente que las proteínas estaban compuestas de aminoácidos; sin embargo, aún se estaba debatiendo si las proteínas eran coloides o macromoléculas. Una proteína que se investigaba en ese momento era la hemoglobina. Se determinó que tenía 712 de carbono, 1130 de hidrógeno, 243 de oxígeno, dos átomos de azufre y al menos un átomo de hierro. Esto le dio a la hemoglobina un peso resultante de aproximadamente 16 000 dalton (Da), pero no estaba claro si este valor era un múltiplo de uno o cuatro (dependiendo del número de átomos de hierro presentes).

A través de una serie de experimentos que utilizaron la técnica de equilibrio de sedimentación, se hicieron dos observaciones importantes: la hemoglobina tiene un peso molecular de 68 000 Da, lo que sugiere que hay cuatro átomos de hierro presentes en lugar de uno, y que, sin importar dónde se encuentre la hemoglobina aislado de, tenía exactamente el mismo peso molecular. La forma en que algo de una masa molecular tan grande se pudo encontrar constantemente, independientemente de dónde se tomó la muestra en el cuerpo, no tenía precedentes y favorecía la idea de que las proteínas son macromoléculas en lugar de coloides. Para investigar este fenómeno, se necesitaba una centrífuga con velocidades aún mayores, por lo que se creó la ultracentrífuga para aplicar la teoría de la sedimentación-difusión. Se determinó la misma masa molecular y la presencia de un límite de expansión sugirió que se trataba de una única partícula compacta. La aplicación adicional de centrifugación mostró que, en diferentes condiciones, las partículas homogéneas grandes se podían descomponer en subunidades discretas. El desarrollo de la centrifugación fue un gran avance en la ciencia de las proteínas experimentales.

Linderstorm-Lang, en 1937, descubrió que los tubos de gradiente de densidad podían usarse para medir la densidad. Descubrió esto cuando trabajaba con el virus de la enana amarilla de la papa. Este método también se utilizó en el famoso experimento de Meselson y Stahl en el que demostraron que la replicación del ADN es semiconservadora mediante el uso de diferentes isótopos de nitrógeno. Utilizaron la centrifugación en gradiente de densidad para determinar qué isótopo o isótopos de nitrógeno estaban presentes en el ADN después de los ciclos de replicación.