Cartilla (biología molecular)

El tenedor de replicación de ADN. Imprenta de ARN etiquetado en la parte superior.

Un cebador es un ácido nucleico monocatenario corto utilizado por todos los organismos vivos en el inicio de la síntesis de ADN. Las enzimas de la ADN polimerasa (responsable de la replicación del ADN) solo son capaces de agregar nucleótidos al extremo 3' de un ácido nucleico existente, lo que requiere que se una un cebador a la plantilla antes de que la ADN polimerasa pueda comenzar una cadena complementaria. La ADN polimerasa agrega nucleótidos después de unirse al cebador de ARN y sintetiza la hebra completa. Más tarde, las hebras de ARN deben eliminarse con precisión y reemplazarlas con nucleótidos de ADN que forman una región de brecha conocida como muesca que se rellena con una enzima llamada ligasa. El proceso de eliminación del cebador de ARN requiere varias enzimas, como Fen1, Lig1 y otras que funcionan en coordinación con la ADN polimerasa, para garantizar la eliminación de los nucleótidos de ARN y la adición de nucleótidos de ADN. Los organismos vivos utilizan únicamente cebadores de ARN, mientras que las técnicas de laboratorio en bioquímica y biología molecular que requieren la síntesis de ADN in vitro (como la secuenciación del ADN y la reacción en cadena de la polimerasa) suelen utilizar cebadores de ADN, ya que son más estables a la temperatura. Los cebadores se pueden diseñar en el laboratorio para reacciones específicas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Al diseñar cebadores de PCR, hay medidas específicas que se deben tener en cuenta, como la temperatura de fusión de los cebadores y la temperatura de hibridación de la propia reacción. Además, la secuencia de unión al ADN del cebador in vitro debe elegirse específicamente, lo que se hace mediante un método denominado herramienta básica de búsqueda de alineamiento local (BLAST) que escanea el ADN y encuentra regiones específicas y únicas para que se una el cebador.

Cabadores de ARN in vivo

Los cebadores de ARN son utilizados por los organismos vivos en el inicio de la síntesis de una hebra de ADN. Una clase de enzimas llamadas primasas añaden un cebador de ARN complementario a la plantilla de lectura de novo tanto en la cadena principal como en la retrasada. A partir del 3'-OH libre del iniciador, conocido como terminal del iniciador, una ADN polimerasa puede extender una hebra recién sintetizada. La hebra principal en la replicación del ADN se sintetiza en una pieza continua que se mueve con la horquilla de replicación, lo que requiere solo un cebador de ARN inicial para comenzar la síntesis. En la hebra rezagada, el ADN molde corre en la dirección 5′→3′. Dado que la ADN polimerasa no puede agregar bases en la dirección 3'→5' complementarias a la hebra molde, el ADN se sintetiza "hacia atrás" en fragmentos cortos que se alejan de la horquilla de replicación, conocidos como fragmentos de Okazaki. A diferencia de la cadena principal, este método da como resultado el inicio y la detención repetidos de la síntesis de ADN, lo que requiere múltiples cebadores de ARN. A lo largo de la plantilla de ADN, la primasa intercala cebadores de ARN que la ADN polimerasa utiliza para sintetizar ADN en la dirección 5′→3′.

Otro ejemplo de cebadores que se utilizan para permitir la síntesis de ADN es la transcripción inversa. La transcriptasa inversa es una enzima que utiliza una cadena molde de ARN para sintetizar una cadena complementaria de ADN. El componente de polimerasa de ADN de la transcriptasa inversa requiere un 3' fin para comenzar la síntesis.

Eliminación de imprimación

Después de la inserción de fragmentos de Okazaki, los cebadores de ARN se eliminan (el mecanismo de eliminación difiere entre procariotas y eucariotas) y se reemplazan con nuevos desoxirribonucleótidos que llenan los espacios donde estaba presente el cebador de ARN. Luego, la ADN ligasa une las hebras fragmentadas, completando la síntesis de la hebra rezagada.

En procariotas, la ADN polimerasa I sintetiza el fragmento de Okazaki hasta que alcanza el cebador de ARN anterior. Luego, la enzima actúa simultáneamente como una exonucleasa 5′→3′, eliminando los ribonucleótidos cebadores por delante y añadiendo desoxirribonucleótidos por detrás. Tanto la actividad de polimerización como la de escisión del cebador de ARN ocurren en la dirección 5′→3′ y la polimerasa I puede realizar estas actividades simultáneamente; esto se conoce como “Traducción de Nick”. La traducción de Nick se refiere a la actividad sincronizada de la polimerasa I en la eliminación del cebador de ARN y la adición de desoxirribonucleótidos. Más tarde, se forma un espacio entre las hebras llamado muesca, que se sella con una ligasa de ADN.

En eucariotas, la eliminación de cebadores de ARN en la hebra rezagada es esencial para completar la replicación. Por lo tanto, a medida que la ADN polimerasa δ sintetiza la hebra rezagada en la dirección 5′→3′, se forman fragmentos de Okazaki, que son hebras discontinuas de ADN. Luego, cuando la ADN polimerasa llega al extremo 5' del cebador de ARN del fragmento de Okazaki anterior, desplaza el extremo 5' del cebador en un colgajo de ARN monocatenario que se elimina mediante la escisión de la nucleasa. La escisión de las aletas de ARN implica tres métodos de eliminación de cebadores. La primera posibilidad de eliminar el cebador es mediante la creación de un colgajo corto que se elimina directamente mediante la endonucleasa 1 específica de la estructura del colgajo (FEN-1), que corta el colgajo sobresaliente de 5'. Este método se conoce como la vía de colgajo corto de eliminación de cebadores de ARN. La segunda forma de escindir un cebador de ARN es degradando la hebra de ARN usando una RNasa, en eucariotas se conoce como RNasa H2. Esta enzima degrada la mayor parte del cebador de ARN hibridado, excepto los nucleótidos cercanos al extremo 5' del cebador. Por lo tanto, los nucleótidos restantes se muestran en un colgajo que se escinde con FEN-1. El último método posible para eliminar el cebador de ARN se conoce como vía de colgajo largo. En esta vía, se reclutan varias enzimas para alargar el cebador de ARN y luego escindirlo. Las aletas son alargadas por una helicasa de 5' a 3', conocida como Pif1. Después de la adición de nucleótidos al colgajo por Pif1, el colgajo largo es estabilizado por la proteína de replicación A (RPA). El ADN unido a RPA inhibe la actividad o el reclutamiento de FEN1, por lo que se debe reclutar otra nucleasa para romper el colgajo. Esta segunda nucleasa es la nucleasa DNA2 que tiene una actividad helicasa-nucleasa, que escinde el colgajo largo del cebador de ARN, que luego deja un par de nucleótidos que son escindidos por FEN1. Al final, cuando se han eliminado todos los cebadores de ARN, se forman mellas entre los fragmentos de Okazaki que se rellenan con desoxirribonucleótidos usando una enzima conocida como ligasa1, a través de un proceso llamado ligadura.

Usos de las imprimaciones sintéticas

Representación diagramatica de las imprimaciones delanteras e inversas para un PCR estándar

Los cebadores sintéticos son oligonucleótidos sintetizados químicamente, generalmente de ADN, que se pueden personalizar para hibridarse con un sitio específico en la plantilla de ADN. En solución, el cebador se hibrida espontáneamente con la plantilla a través del apareamiento de bases de Watson-Crick antes de ser extendido por la ADN polimerasa. La capacidad de crear y personalizar cebadores sintéticos ha demostrado ser una herramienta invaluable necesaria para una variedad de enfoques de biología molecular que involucran el análisis de ADN. Tanto el método de terminación de cadena de Sanger como el método de secuenciación de ADN de "próxima generación" requieren cebadores para iniciar la reacción.

Diseño de cebadores de PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utiliza un par de cebadores personalizados para dirigir la elongación del ADN entre sí en los extremos opuestos de la secuencia que se amplifica. Estos cebadores suelen tener entre 18 y 24 bases de longitud y deben codificar solo los sitios específicos aguas arriba y aguas abajo de la secuencia que se está amplificando. Un cebador que pueda unirse a múltiples regiones a lo largo del ADN las amplificará todas, eliminando el propósito de la PCR.

Se deben tener en cuenta algunos criterios al diseñar un par de cebadores de PCR. Los pares de cebadores deben tener temperaturas de fusión similares, ya que la hibridación durante la PCR ocurre para ambas hebras simultáneamente, y esta temperatura de fusión compartida no debe ser ni mucho mayor ni menor que la temperatura de hibridación de la reacción. Un cebador con una T_m (temperatura de fusión) demasiado más alta que la temperatura de hibridación de la reacción puede desinhibirse y extenderse en una ubicación incorrecta a lo largo de la secuencia de ADN. Una T_m significativamente más baja que la temperatura de recocido puede fallar en recocer y extenderse en absoluto.

Además, las secuencias de cebadores deben elegirse para seleccionar de forma única una región de ADN, evitando la posibilidad de hibridación con una secuencia similar cercana. Un método comúnmente utilizado para seleccionar un sitio de cebador es la búsqueda BLAST, mediante la cual se pueden ver todas las regiones posibles a las que se puede unir un cebador. Tanto la secuencia de nucleótidos como el propio cebador pueden buscarse mediante BLAST. La herramienta gratuita NCBI Primer-BLAST integra el diseño de cebadores y la búsqueda BLAST en una sola aplicación, al igual que los productos de software comercial como ePrime y Beacon Designer. Se pueden realizar simulaciones por computadora de los resultados teóricos de la PCR (PCR electrónica) para ayudar en el diseño del cebador proporcionando temperaturas de fusión y recocido, etc.

A partir de 2014, muchas herramientas en línea están disponibles gratuitamente para el diseño de cebadores, algunas de las cuales se enfocan en aplicaciones específicas de PCR. Los cebadores con alta especificidad para un subconjunto de plantillas de ADN en presencia de muchas variantes similares se pueden diseñar utilizando DECIPHER.

La selección de una región específica de ADN para la unión del cebador requiere algunas consideraciones adicionales. Deben evitarse las regiones con muchas repeticiones de mononucleótidos y dinucleótidos, ya que puede producirse la formación de bucles y contribuir a la mala hibridación. Los primarios no deben recocerse fácilmente con otros primarios en la mezcla; este fenómeno puede conducir a la producción de 'dímero de cebador' productos que contaminan la solución final. Los cebadores tampoco deben hibridarse fuertemente entre sí, ya que las horquillas y bucles internos podrían dificultar la hibridación con el ADN molde.

Cuando se diseñan cebadores, se pueden agregar bases de nucleótidos adicionales a los extremos posteriores de cada cebador, lo que da como resultado una secuencia cap personalizada en cada extremo de la región amplificada. Una aplicación para esta práctica es para su uso en la clonación TA, una técnica especial de subclonación similar a la PCR, donde la eficiencia se puede aumentar agregando colas AG a los extremos 5 'y 3'.

Imprimaciones degeneradas

Algunas situaciones pueden requerir el uso de cebadores degenerados. Estas son mezclas de cebadores que son similares, pero no idénticos. Estos pueden ser convenientes cuando se amplifica el mismo gen de diferentes organismos, ya que las secuencias son probablemente similares pero no idénticas. Esta técnica es útil porque el código genético en sí está degenerado, lo que significa que varios codones diferentes pueden codificar el mismo aminoácido. Esto permite que diferentes organismos tengan una secuencia genética significativamente diferente que codifica una proteína muy similar. Por esta razón, los cebadores degenerados también se utilizan cuando el diseño del cebador se basa en la secuencia de la proteína, ya que no se conoce la secuencia específica de los codones. Por lo tanto, la secuencia del cebador correspondiente al aminoácido isoleucina podría ser "ATH", donde A representa adenina, T timina y H adenina, timina o citosina, según el código genético de cada codón. usando los símbolos IUPAC para bases degeneradas. Los cebadores degenerados pueden no hibridarse perfectamente con una secuencia objetivo, lo que puede reducir en gran medida la especificidad de la amplificación por PCR.

Los cebadores degenerados son ampliamente utilizados y extremadamente útiles en el campo de la ecología microbiana. Permiten la amplificación de genes de microorganismos no cultivados hasta el momento o permiten la recuperación de genes de organismos en los que no se dispone de información genómica. Por lo general, los cebadores degenerados se diseñan alineando la secuenciación de genes que se encuentra en GenBank. Las diferencias entre secuencias se explican mediante el uso de degeneraciones IUPAC para bases individuales. Los cebadores de PCR luego se sintetizan como una mezcla de cebadores correspondientes a todas las permutaciones de la secuencia de codones.