Calorimetría de titulación isotérmica

En termodinámica química, la calorimetría de titulación isotérmica (CTI) es una técnica física que se utiliza para determinar los parámetros termodinámicos de las interacciones en solución. Se utiliza con mayor frecuencia para estudiar la unión de moléculas pequeñas (como compuestos medicinales) a macromoléculas más grandes (proteínas, ADN, etc.) en un entorno sin marcadores. Consiste en dos celdas que están encerradas en una cubierta adiabática. Los compuestos que se van a estudiar se colocan en la celda de muestra, mientras que la otra celda, la celda de referencia, se utiliza como control y contiene el tampón en el que se disuelve la muestra.

La técnica fue desarrollada por H. D. Johnston en 1968 como parte de su tesis doctoral en la Universidad Brigham Young, y se consideró un nicho hasta que MicroCal Inc. la introdujo comercialmente en 1988. En comparación con otros calorímetros, el ITC tiene la ventaja de que no requiere ningún corrector, ya que no hay intercambio de calor entre el sistema y el medio ambiente.

El CCI es una técnica cuantitativa que puede determinar la afinidad vinculante (${\displaystyle K_{a}$), reacción enthalpy (${\displaystyle \Delta H}$), y la estoichiometría vinculante (${\displaystyle n}$) de la interacción entre dos o más moléculas en solución. Esto se logra midiendo los enthalpies de una serie de reacciones vinculantes causadas por inyecciones de una solución de una molécula a una célula de reacción que contiene una solución de otra molécula. Los valores enthalpy se trazan sobre las ratios molares resultantes de las inyecciones. De la trama, la reacción molar enthalpy ${\displaystyle \Delta H}$, la constante de afinidad (${\displaystyle K_{a}$) y la estoquiometría se determina por ajuste curva. La reacción es Gibbs cambio de energía libre (${\displaystyle \Delta G}$) y cambio de entropía (${\displaystyle \Delta S}$) se puede determinar utilizando la relación:

${\displaystyle \Delta G=-RT\ln {K_{a}=\ Delta H-T\Delta S}$

(donde) ${\displaystyle R.$ es la constante del gas y ${\displaystyle T}$ es la temperatura absoluta).

Para obtener mediciones precisas de la afinidad de unión, la curva del termograma debe ser sigmoidea. El perfil de la curva está determinado por el valor c, que se calcula mediante la ecuación:

${\displaystyle c=nK_{a}M}$

Donde ${\displaystyle n}$ es la esteichiometría de la unión, ${\displaystyle K_{a}$ es la asociación constante y ${\displaystyle M}$ es la concentración de la molécula en la célula. El valor c debe caer entre 1 y 1000, idealmente entre 10 y 100. En términos de afinidad vinculante, sería aproximadamente de ${\displaystyle 1.0\times 10^{3}$ ~ ${\displaystyle 10^{7}$dentro del rango límite.

Un calorímetro de titulación isotérmica se compone de dos celdas idénticas hechas de un material conductor térmico y químicamente inerte de alta eficiencia, como una aleación de Hastelloy u oro, rodeadas por una cubierta adiabática. Se utilizan circuitos sensibles de termopila/termopar para detectar las diferencias de temperatura entre la celda de referencia (llena de tampón o agua) y la celda de muestra que contiene la macromolécula. Antes de agregar el ligando, se aplica una potencia constante (<1 mW) a la celda de referencia. Esto dirige un circuito de retroalimentación, que activa un calentador ubicado en la celda de muestra. Durante el experimento, el ligando se titula en la celda de muestra en alícuotas conocidas con precisión, lo que hace que se absorba o se desprenda calor (según la naturaleza de la reacción). Las mediciones consisten en la entrada de potencia dependiente del tiempo necesaria para mantener temperaturas iguales entre la muestra y las celdas de referencia.

En una reacción exotérmica, la temperatura en la celda de muestra aumenta al agregar el ligando. Esto hace que la potencia de retroalimentación a la celda de muestra disminuya (recuerde: se aplica una potencia de referencia a la celda de referencia) para mantener una temperatura igual entre las dos celdas. En una reacción endotérmica, ocurre lo opuesto; el circuito de retroalimentación aumenta la potencia para mantener una temperatura constante (operación isotérmica).

Las observaciones se representan gráficamente como la potencia necesaria para mantener la celda de referencia y la celda de muestra a una temperatura idéntica en función del tiempo. Como resultado, los datos experimentales sin procesar consisten en una serie de picos de flujo de calor (potencia), y cada pico corresponde a una inyección de ligando. Estos picos/pulsos de flujo de calor se integran con respecto al tiempo, lo que da el calor total intercambiado por inyección. El patrón de estos efectos de calor en función de la relación molar [ligando]/[macromolécula] se puede analizar luego para dar los parámetros termodinámicos de la interacción en estudio.

Para obtener un resultado óptimo, cada inyección debe tener el tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio de la reacción. A menudo es necesario desgasificar las muestras para obtener buenas mediciones, ya que la presencia de burbujas de gas dentro de la celda de muestra dará lugar a gráficos de datos anormales en los resultados registrados. Todo el experimento se lleva a cabo bajo control informático.

La titulación directa se realiza más comúnmente con ITC para obtener los datos termodinámicos, mediante la unión directa de dos componentes de la reacción entre sí. Sin embargo, muchas de las reacciones químicas e interacciones de unión pueden tener una afinidad de unión superior a la deseable con la ventana C. Para solucionar la limitación de la ventana C y las condiciones para ciertas interacciones de unión, se pueden realizar varios métodos diferentes de titulación. En algunos casos, simplemente hacer una titulación inversa cambiando las muestras entre la jeringa de inyección y la celda de muestra puede resolver el problema, según el mecanismo de unión. Para la mayoría de las uniones de alta o baja afinidad, se requiere quelación o titulación competitiva. Este método se realiza cargando una solución compleja previamente unida en la celda de muestra y quelando uno de los componentes con un reactivo de mayor afinidad de unión observada dentro de la ventana C deseada.

Los datos experimentales reunidos reflejan no sólo la termodinámica vinculante de la interacción del interés, sino cualquier equilibria concurrente asociada a ella. Se puede realizar un análisis post-hoc para determinar el búfer o la enthalpy dependiente del solvente de la termodinámica experimental, simplemente pasando por el proceso de la ley de Hess. El siguiente ejemplo muestra una interacción simple entre un ion metálico (M) y un ligand (L). B representa el búfer utilizado para esta interacción y ${\displaystyle {\ce {}}}}$ representa protones.

${\displaystyle {\ce {\cH00FF}$ ${\fnMicrosoft {\fnMicrosoft {\fnMicrosoft {\fnMicrosoft {\fnMicrosoft {\f}\\fnMicrosoft {\\\fnMicrosoft {\fnMicrosoft {\fnMicrosoft}\\\fnMicrosoft {\\\fnMicrosoft\\\fnMicrosoft\\\\\\\\\\fnMicrosoft\\\\\\\\\fnMicrosoft\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\fnMicrosoft\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\fnMicrosoft\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ {-\Delta H_{MB}}}$

${\displaystyle {\ce {\cH} {\cH0}}$ ${\displaystyle -(n_{H+})\Delta H_{LH}$

${\displaystyle {\ce {\cH+ + B ==}}}$ ${\displaystyle (n_{H+})\Delta H_{BH}$

${\displaystyle {\ce {\cH00} {\cH00}}}$ ${\displaystyle Delta H_{ML}}$

Por lo tanto,

${\displaystyle \Delta H_{ITC}=-\Delta H_{MB}-(n_{H+})\Delta H_{LH}+(n_{H+})\ Delta H_{BH}+\Delta H_{ML}$

que puede procesarse posteriormente para calcular la entalpía de la interacción metal-ligando. Aunque este ejemplo es entre un metal y un ligando, es aplicable a cualquier experimento de ITC, en lo que respecta a las interacciones de enlace.

Como parte del análisis, se requiere una cantidad de protones para calcular la termodinámica independiente del solvente. Esto se puede hacer fácilmente trazando un gráfico como el que se muestra a continuación.

La ecuación lineal de este gráfico es la versión reorganizada de la ecuación anterior a partir del análisis post-hoc en la forma y = mx + b:

${\displaystyle \Delta H_{ITC}=(n_{H+})\Delta H_{BH}+[-\] Delta H_{MB}-(n_{H+})\Delta H_{LH}+\Delta H_{ML}$

La constante de equilibrio de la reacción tampoco es independiente de los demás equilibrios en competencia. La competencia incluiría interacciones con el tampón y otras reacciones dependientes del pH según las condiciones experimentales. La competencia con especies distintas a la especie de interés se incluye en el factor de competencia, Q, en la siguiente ecuación:

${\displaystyle Q=\Sigma (\beta _{n}[\mathrm {X}_{n}}$

¿Dónde? ${\displaystyle X}$ representa especies como un búfer o protones, ${\displaystyle \beta }$ representa su constante equilibrio, cuando,

${\displaystyle K_{ML}=K_{ITC}Q$

Durante los últimos 30 años, la calorimetría de titulación isotérmica se ha utilizado en una amplia gama de campos. En el pasado, esta técnica se utilizaba para determinar valores termodinámicos fundamentales para interacciones moleculares pequeñas básicas. En los últimos años, la calorimetría de titulación isotérmica se ha utilizado en áreas con mayor aplicación industrial, como el descubrimiento de fármacos y la prueba de materiales sintéticos. Aunque todavía se utiliza mucho en química fundamental, la tendencia se ha desplazado hacia el lado biológico, donde los valores independientes del tampón y sin etiqueta son relativamente más difíciles de lograr.

Utilizando los datos termodinámicos de ITC, es posible deducir la cinética enzimática, incluyendo la transferencia de protones o electrones, la alosteria y la cooperatividad, y la inhibición enzimática. ITC recopila datos a lo largo del tiempo que son útiles para cualquier experimento cinético, pero especialmente con las proteínas debido a alícuotas constantes de inyecciones. En términos de cálculo, la constante de equilibrio y las pendientes de unión se pueden utilizar directamente para determinar la alosteria y la transferencia de carga, mediante la comparación de datos experimentales de diferentes condiciones (pH, uso de cadena peptídica mutada y sitios de unión, etc.).

Las proteínas de membrana y las propiedades de autoensamblaje de ciertas proteínas se pueden estudiar con esta técnica, debido a que se trata de un calorímetro sin etiquetas. Se sabe que las proteínas de membrana tienen dificultades con la selección de protocolos de solubilización y purificación adecuados. Como la ITC es una herramienta calorimétrica no destructiva, se puede utilizar como detector para localizar la fracción de proteína con sitios de unión deseados, mediante la unión de un ligando de unión conocido a la proteína. Esta característica también se aplica en estudios de proteínas autoensambladas, especialmente en el uso de la medición de la termodinámica de su transformación estructural.

La afinidad de unión tiene una enorme importancia en la química médica, ya que los fármacos deben unirse a la proteína de manera efectiva dentro de un rango deseado. Sin embargo, determinar los cambios de entalpía y optimizar los parámetros termodinámicos son enormemente difíciles al diseñar fármacos. ITC resuelve este problema fácilmente al deducir la afinidad de unión, las contribuciones entálpicas/entrópicas y su estequiometría de unión.

Aplicando las ideas anteriores, también se puede deducir la quiralidad de los compuestos organometálicos con esta técnica. Cada compuesto quiral tiene sus propias propiedades y mecanismos de unión únicos que son comparables entre sí, lo que conduce a diferencias en las propiedades termodinámicas. Al unir soluciones quirales en un sitio de unión se puede deducir el tipo de quiralidad y, dependiendo del propósito, qué compuesto quiral es más adecuado para la unión.

La unión de iones metálicos a proteínas y otros componentes del material biológico es uno de los usos más populares de la ITC, desde el estudio de unión de ovotransferrina a hierro férrico publicado por Lin et al. de MicroCal Inc. Esto se debe a que algunos de los iones metálicos utilizados en sistemas biológicos tienen una configuración electrónica d¹⁰ que no se puede estudiar con otras técnicas comunes como la espectrofotometría UV-vis o la resonancia paramagnética electrónica. También está estrechamente relacionado con los estudios bioquímicos y medicinales debido a la gran abundancia de enzimas que se unen a metales en los sistemas biológicos.

La técnica se ha utilizado ampliamente en el estudio de nanotubos de carbono para determinar interacciones de unión termodinámicas con moléculas biológicas e interacciones de compuestos de grafeno. Otro uso notable de la ITC con nanotubos de carbono es la optimización de la preparación de nanotubos de carbono a partir de compuestos de grafeno y alcohol polivinílico (PVA). El proceso de ensamblaje del PVA se puede medir termodinámicamente, ya que la mezcla de los dos ingredientes es una reacción exotérmica y su tendencia de unión se puede observar fácilmente mediante la ITC.

• Escaneo diferencial calorías
• Interferometría de polarización dual
• Sorpción de calorías
• Presión de perturbación calorimetría
• Resonancia de plasmón superficial