Bromuro de etidio
Bromuro de etidio (o bromuro de homidio, sal de cloruro cloruro de homidio) es un agente intercalante comúnmente utilizado como etiqueta fluorescente (tinción de ácido nucleico) en laboratorios de biología molecular para técnicas como la electroforesis en gel de agarosa. Comúnmente se abrevia como EtBr, que también es una abreviatura de bromoetano. Para evitar confusiones, algunos laboratorios han utilizado la abreviatura EthBr para esta sal. Cuando se expone a la luz ultravioleta, emitirá una fluorescencia de color naranja, intensificándose casi 20 veces después de unirse al ADN. Con el nombre de homidium, se utiliza habitualmente desde los años 50 en medicina veterinaria para tratar la tripanosomiasis en el ganado. La alta incidencia de resistencia a los antimicrobianos hace que este tratamiento no sea práctico en algunas áreas, donde en su lugar se utiliza el cloruro de isometamidio relacionado. A pesar de su reputación como mutágeno, las pruebas han demostrado que tiene una baja mutagenicidad sin activación metabólica.
Estructura, química y fluorescencia
Como ocurre con la mayoría de los compuestos fluorescentes, el bromuro de etidio es aromático. Su fracción heterocíclica central se conoce genéricamente como fenantridina, cuyo isómero es el colorante fluorescente acridina. Los máximos de absorción de EtBr en solución acuosa se encuentran a 210 nm y 285 nm, que corresponden a la luz ultravioleta. Como resultado de esta excitación, EtBr emite luz naranja con una longitud de onda de 605 nm.
La intensa fluorescencia del bromuro de etidio después de unirse al ADN probablemente no se debe a una estabilización rígida del resto fenilo, porque se ha demostrado que el anillo de fenilo se proyecta fuera de las bases intercaladas. De hecho, se encuentra que el grupo fenilo es casi perpendicular al plano del sistema de anillos, ya que gira alrededor de su enlace simple para encontrar una posición en la que incida mínimamente sobre el sistema de anillos. En cambio, se cree que el responsable es el entorno hidrofóbico que se encuentra entre los pares de bases. Al entrar en este entorno hidrofóbico y alejarse del disolvente, el catión etidio se ve obligado a desprenderse de cualquier molécula de agua que estuviera asociada con él. Como el agua es un extintor de fluorescencia muy eficaz, la eliminación de estas moléculas de agua permite que el etidio emita fluorescencia.
Aplicaciones
El bromuro de etidio se usa comúnmente para detectar ácidos nucleicos en laboratorios de biología molecular. En el caso del ADN, suele ser ADN bicatenario procedente de PCR, digestiones de restricción, etc. También se puede detectar ARN monocatenario, ya que normalmente se repliega sobre sí mismo y proporciona así un emparejamiento de bases local para que el colorante se intercale. La detección normalmente implica un gel que contiene ácidos nucleicos colocado sobre o debajo de una lámpara ultravioleta. Dado que la luz ultravioleta es perjudicial para los ojos y la piel, los geles teñidos con bromuro de etidio suelen verse indirectamente utilizando una cámara cerrada, y las imágenes fluorescentes se graban como fotografías. Cuando se necesita una visión directa, se deben proteger los ojos y la piel expuesta del espectador. En el laboratorio, las propiedades intercalantes se han utilizado durante mucho tiempo para minimizar la condensación cromosómica cuando un cultivo se expone a agentes de detención de mitosis durante la recolección. Las preparaciones de portaobjetos resultantes permiten un mayor grado de resolución y, por tanto, más confianza a la hora de determinar la integridad estructural de los cromosomas mediante análisis microscópico.
El bromuro de etidio también se utiliza durante la separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa. Se agrega al tampón en ejecución y se une intercalando entre pares de bases de ADN. Cuando el gel de agarosa se ilumina con luz ultravioleta, las bandas de ADN se vuelven visibles. La intercalación de EtBr puede alterar propiedades de la molécula de ADN, como carga, peso, conformación y flexibilidad. Dado que la movilidad de las moléculas de ADN a través del gel de agarosa se mide en relación con un estándar de peso molecular, los efectos del EtBr pueden ser críticos para determinar los tamaños de las moléculas.
El bromuro de etidio también se ha utilizado ampliamente para reducir el número de copias del ADN mitocondrial en células en proliferación. El efecto del EtBr sobre el ADN mitocondrial se utiliza en medicina veterinaria para tratar la tripanosomiasis en el ganado, ya que EtBr se une a moléculas de ADN de cinetoplástido y cambia su conformación a la forma de ADN Z. Esta forma inhibe la replicación del ADN de cinetoplástido, que es letal para los tripanosomas.
La sal cloruro de homidio tiene las mismas aplicaciones.
El bromuro de etidio se puede agregar a los medios YPD y usarse como inhibidor del crecimiento celular.
La afinidad de unión de las nanopartículas catiónicas con el ADN podría evaluarse mediante unión competitiva con bromuro de etidio.
Alternativas al gel
Existen alternativas al bromuro de etidio que se anuncian como menos peligrosas y con mejor rendimiento. Por ejemplo, algunos investigadores utilizan varios tintes a base de SYBR y hay otros tintes emergentes como "Novel Juice". Los colorantes SYBR son menos mutagénicos que el EtBr según la prueba de Ames con extracto de hígado. Sin embargo, se descubrió que SYBR Green I era más mutagénico que EtBr para las células bacterianas expuestas a los rayos UV (que se utilizan para visualizar cualquiera de los tintes). Este puede ser el caso de otros sistemas "más seguros" colorantes, pero si bien se dispone de detalles mutagénicos y de toxicidad, estos no se han publicado en revistas revisadas por pares. La MSDS de SYBR Safe informa una LD50 para ratas de más de 5 g/kg, que es más alta que la del EtBr (1,5 g/kg). Muchos tintes alternativos están suspendidos en DMSO, lo que tiene sus propias implicaciones para la salud, incluida una mayor absorción cutánea de compuestos orgánicos. A pesar de la ventaja de rendimiento que supone utilizar tintes SYBR en lugar de EtBr para teñir, muchos investigadores todavía prefieren el EtBr porque es considerablemente menos costoso.
Posible actividad cancerígena
La mayor parte del uso de bromuro de etidio en el laboratorio (0,25–1 μg/ml) está por debajo de la dosis LD50, lo que hace que la toxicidad aguda sea poco probable. Se necesitarían pruebas en humanos y estudios más prolongados en un sistema de mamíferos para comprender completamente el riesgo a largo plazo que representa el bromuro de etidio para los trabajadores de laboratorio, pero está claro que el bromuro de etidio puede causar mutaciones en células de mamíferos y bacterias.
Manipulación y eliminación
El bromuro de etidio no está regulado como residuo peligroso en concentraciones bajas, pero muchas organizaciones lo tratan como residuo peligroso. El material debe manipularse de acuerdo con la Hoja de datos de seguridad (SDS) del fabricante.
La eliminación del bromuro de etidio de laboratorio sigue siendo un tema controvertido. El bromuro de etidio puede degradarse químicamente o recolectarse e incinerarse. Es común que los desechos de bromuro de etidio por debajo de una concentración obligatoria se eliminen normalmente (por ejemplo, vertiéndolos por un desagüe). Una práctica común es tratar el bromuro de etidio con hipoclorito de sodio (lejía) antes de desecharlo. Según Lunn y Sansone, la degradación química con lejía produce compuestos que son mutagénicos según la prueba de Ames. Faltan datos sobre los efectos mutagénicos de los productos de degradación. Lunn y Sansone describen métodos más eficaces de degradación. En otros lugares, se recomienda la eliminación del bromuro de etidio de las soluciones con carbón activado o resina de intercambio iónico. Hay varios productos comerciales disponibles para este uso.
Resistencia a los medicamentos
Los tripanosomas en el valle del río Gibe en el suroeste de Etiopía mostraron resistencia universal entre julio de 1989 y febrero de 1993. Esto probablemente indica una pérdida permanente de función en esta área frente al objetivo probado, T. congolense aislado de ganado boran.