Biotinilación

En bioquímica, la biotinilación es el proceso de unir covalentemente biotina a una proteína, ácido nucleico u otra molécula. La biotinilación es rápida, específica y es poco probable que perturbe la función natural de la molécula debido al pequeño tamaño de la biotina (PM = 244,31 g/mol). La biotina se une a la estreptavidina y la avidina con una afinidad extremadamente alta, una velocidad de activación rápida y una alta especificidad, y estas interacciones se explotan en muchas áreas de la biotecnología para aislar moléculas biotiniladas de interés. La unión de biotina a estreptavidina y avidina es resistente a calor, pH y proteólisis extremos, lo que hace posible la captura de moléculas biotiniladas en una amplia variedad de entornos. Además, se pueden conjugar múltiples moléculas de biotina con una proteína de interés, lo que permite la unión de múltiples moléculas de proteína de estreptavidina, avidina o neutravidina y aumenta la sensibilidad de detección de la proteína de interés. Existe una gran cantidad de reactivos de biotinilación disponibles que aprovechan la amplia gama de métodos de etiquetado posibles. Debido a la fuerte afinidad entre la biotina y la estreptavidina, la purificación de proteínas biotiniladas ha sido un enfoque ampliamente utilizado para identificar interacciones proteína-proteína y eventos postraduccionales como la ubiquitilación en biología molecular.

Métodos de etiquetado

Las proteínas se pueden biotinilar química o enzimáticamente. La biotinilación química utiliza diversas químicas de conjugación para producir una biotinilación inespecífica de aminas, carboxilatos, sulfhidrilos y carbohidratos (p. ej., el acoplamiento NHS proporciona biotinilación de cualquier amina primaria en la proteína). La biotinilación enzimática da como resultado la biotinilación de una lisina específica dentro de una secuencia determinada mediante una biotina ligasa bacteriana. La mayoría de los reactivos de biotinilación química consisten en un grupo reactivo unido mediante un conector a la cadena lateral del ácido valérico de la biotina. Como la bolsa de unión de biotina en avidina/estreptavidina está enterrada debajo de la superficie de la proteína, son deseables reactivos de biotinilación que posean un conector más largo, ya que permiten que la molécula de biotina, una vez que se ha unido a su objetivo, sea más accesible para unirse a avidina/estreptavidina. /Proteína neutravidina. Este conector también puede mediar en la solubilidad de los reactivos de biotinilación; los enlazadores que incorporan poli(etilen)glicol (PEG) pueden hacer que los reactivos insolubles en agua sean solubles o aumentar la solubilidad de los reactivos de biotinilación que ya son solubles hasta cierto punto.

Biotinilación enzimática

A diferencia de los métodos de biotinilación química, la biotinilación enzimática permite que la biotina se una a exactamente un residuo presente en la proteína. Esta reacción de biotinilación también puede completarse, lo que significa que el producto se genera con alta uniformidad y puede unirse a estreptavidina en una orientación definida, p. para multímeros MHC. La biotinilación enzimática la lleva a cabo con mayor frecuencia E. coli biotina holoenzima sintetasa, también conocida como biotina ligasa (BirA, P06709).

La forma más común de atacar una proteína de interés es fusionar la proteína en su extremo N, extremo C o en un bucle interno con un péptido de 15 aminoácidos (GLNDIFEAQKIEWHE), denominado AviTag o péptido aceptor (AP). Una vez marcada, la proteína se incuba con BirA, lo que permite que se produzca la biotinilación en presencia de biotina y ATP. La biotinilación enzimática se puede llevar a cabo in vitro, pero BirA también reacciona específicamente con su péptido diana dentro de células de mamíferos y bacterias y en la superficie celular, mientras que otras proteínas celulares no se modifican. La biotinilación enzimática también puede tener lugar in vivo normalmente mediante la coexpresión de una proteína marcada con Avitag y BirA.

El sustrato natural de BirA es la proteína transportadora de carboxilo de biotina (BCCP). Antes de que se descubrieran etiquetas más pequeñas, era necesario fusionar una proteína con todo el BCCP para poder atacarla. Una proteína fusionada por BCCP puede ser reconocida por moléculas de biotina in vivo y unirse a ella. Se han utilizado algunas otras etiquetas pequeñas antes de AviTag, pero AviTag es el más eficiente hasta ahora.

Biotinilación de amina primaria

Los objetivos más comunes para la modificación de las moléculas de proteína son los grupos primarios de amina que están presentes como cadena lateral de lisina epsilon-aminas y α-aminas N-terminal. Los reactivos de biotinilación reactiva amina pueden dividirse en dos grupos basados en la solubilidad del agua.

Los ésteres de N-hidroxysuccinimide (NHS) tienen poca solubilidad en soluciones acuosas. Para las reacciones en solución acuosa, primero deben ser disueltas en un solvente orgánico, luego diluidas en la mezcla de reacción acuosa. Los disolventes orgánicos más utilizados para este propósito son sulfóxido de dimetil (DMSO) y formamida de dimetil (DMF), que son compatibles con la mayoría de proteínas en bajas concentraciones. Debido a la hidrofobicidad de los equipos NHS, los reactivos de biotinilación NHS también pueden difusarse a través de la membrana celular, lo que significa que se biotinilizarán tanto componentes internos como externos de una célula.

Los ésteres Sulfo-NHS son más solubles en agua y deben ser disueltos en agua justo antes de usarse porque se hidrolizan fácilmente. La solubilidad del agua de los sulfo-NHS-esters se deriva de su grupo sulfonado en el anillo N-hidroxisuccinimida y elimina la necesidad de disolver el reactivo en un solvente orgánico. Sulfo-NHS-esters de biotina también se puede utilizar como reactivos de biotinilación de superficie celular, porque no penetran la membrana celular.

Las reacciones químicas de los ésteres NHS- y sulfo-NHS son esencialmente idénticas, ya que ambos reaccionan espontáneamente con aminas para formar un enlace amida. Debido a que el objetivo del éster es una amina primaria desprotonada, la reacción se ve favorecida en condiciones básicas (por encima de pH 7). La hidrólisis del éster NHS es una reacción competitiva importante y la velocidad de hidrólisis aumenta al aumentar el pH. Los ésteres NHS y sulfo-NHS tienen una vida media de varias horas a pH 7, pero sólo unos minutos a pH 9.

Hay cierta flexibilidad en las condiciones para conjugar los equipos NHS a las minas primarias. Las temperaturas de incubación pueden oscilar entre 4-37 °C, los valores de pH en el rango de reacción de 7-9, y los tiempos de incubación varían de unos minutos a 12 horas. Se deben evitar los buffers que contienen aminas (como Tris o glicina) porque compiten con la reacción.

Biotinilación de sulfhidrilo

Una alternativa a la biotinilación de aminas primarias es marcar los grupos sulfhidrilo con biotina. Debido a que los grupos sulfhidrilo libres son menos frecuentes en la mayoría de las proteínas en comparación con las aminas primarias, la biotinilación con sulfhidrilo es útil cuando las aminas primarias están ubicadas en los dominios reguladores de la proteína objetivo o cuando se requiere un nivel reducido de biotinilación. Los grupos reactivos con sulfhidrilo, como maleimidas, haloacetilos y disulfuros de piridilo, requieren grupos sulfhidrilo libres para la conjugación; Primero se deben reducir los enlaces disulfuro para liberar los grupos sulfhidrilo para la biotinilación. Si no hay grupos sulfhidrilo libres disponibles, las lisinas se pueden modificar con varios reactivos de tiolación (reactivo de Traut, SAT(PEG4), SATA y SATP), lo que da como resultado la adición de un sulfhidrilo libre. La biotinilación de sulfhidrilo se realiza a un pH ligeramente más bajo (6,5-7,5) que el marcaje con ésteres NHS.

Además de las proteínas completas, los péptidos biotinilados se pueden sintetizar introduciendo un residuo de cisteína (Cys) durante la síntesis en el extremo de la cadena de aminoácidos para obtener una biotinilación orientada y específica del sitio. Los nucleótidos también pueden biotinilarse mediante la incorporación de nucleótidos tiolados.

Biotinil de carboxilo

Los grupos de carboxilo se encuentran en los extremos C-terminal de proteínas y en cadenas laterales de aminoácidos glutamato y aspartato. Biotinylation reagents that target carboxyl groups do not have a carboxyl-reactive moiety per se but instead rely on a carbodiimide crosslinker such as EDC to bind the primary amine on the biotinylation reagents to the carboxyl group on the target protein.

La biotinilación en los grupos carboxilo se produce a un pH de 4,5 a 5,5. Para evitar la reactividad cruzada del reticulante con los constituyentes del tampón, los tampones no deben contener aminas primarias (p. ej., Tris, glicina) ni carboxilos (p. ej., acetato, citrato); El búfer MES es una opción ideal.

Biotinilación de glicoproteínas

Las glicoproteínas se pueden biotinilar modificando los residuos de carbohidratos a aldehídos, que luego reaccionan con reactivos de biotinilación basados en hidrazina o alcoxiamina. El periodato de sodio oxida los ácidos siálicos de las glicoproteínas a aldehídos para formar estos enlaces estables a un pH de 4 a 6.

Los anticuerpos policlonales están fuertemente glicosilados y, debido a que la glicosilación no interfiere con la actividad del anticuerpo, la biotinilación de los grupos glicosilo es una estrategia ideal para generar anticuerpos biotinilados.

Biotinilación de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos se biotinilan fácilmente en el curso de la síntesis de oligonucleótidos mediante el método de la fosforamidita utilizando fosforamidita de biotina comercial. Tras la desprotección estándar, los conjugados obtenidos se pueden purificar mediante HPLC de fase inversa o de intercambio aniónico.

Biotinilación no específica

Los reactivos de biotinilación fotoactivables son ideales cuando las aminas primarias, los sulfhidrilos, los carboxilos y los carbohidratos no están disponibles para el etiquetado. Estos reactivos se basan en arilazidas, que se activan con luz ultravioleta (UV; >350 nm), que luego reaccionan en los enlaces C-H y N-H. Debido a que estos tipos de enlaces ocurren independientemente del tipo de aminoácido, este tipo de biotinilación se denomina "no específica".

Los reactivos de biotinilación fotoactivables también se pueden usar para activar la biotinilación en momentos específicos de un experimento o durante ciertas condiciones de reacción, simplemente exponiendo la reacción a la luz ultravioleta en el momento o condición específicos.

Propósito

Purificación

La etiqueta de biotina se puede utilizar en cromatografía de afinidad junto con una columna que tiene avidina (o estreptavidina o neutravidina) unida, que es el ligando natural de la biotina. Sin embargo, se necesitan condiciones duras (por ejemplo, GuHCl 6 M a pH 1,5) para romper la interacción avidina/estreptavidina-biotina, lo que muy probablemente desnaturalizará la proteína que lleva la etiqueta de biotina. Si es necesario aislar la proteína marcada, es mejor etiquetarla con iminobiotina. Este análogo de biotina proporciona una fuerte unión a avidina/estreptavidina a pH alcalino, pero la afinidad se reduce al reducir el pH. Por lo tanto, se puede liberar una proteína funcional marcada con iminobiotina desde una columna de avidina/estreptavidina disminuyendo el pH (hasta aproximadamente pH 4).

Detección

Esta etiqueta también se puede utilizar en la detección de la proteína mediante anticuerpos antibiotina o estrategias de detección marcadas con avidina/estreptavidina, como indicadores enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina) o sondas fluorescentes. Esto puede resultar útil en la localización mediante microscopía fluorescente o electrónica, ensayos ELISA, ensayos ELISPOT, transferencias Western y otros métodos inmunoanalíticos. La detección con estreptavidina monovalente puede evitar la agrupación o agregación de la diana biotinilada.

Otros usos

El enlace no covalente formado entre la biotina y la avidina o la estreptavidina tiene una afinidad de unión mayor que la de la mayoría de los enlaces de antígenos y anticuerpos y se acerca a la fuerza de un enlace covalente. Esta unión tan estrecha hace que el etiquetado de proteínas con biotina sea una herramienta útil para aplicaciones como la cromatografía de afinidad utilizando avidina o estreptavidina inmovilizadas para separar la proteína biotinilada de una mezcla de otras proteínas y productos bioquímicos. La proteína biotinilada, como la albúmina sérica bovina (BSA) biotinilada, se utiliza en ensayos en fase sólida como revestimiento en la superficie de los pocillos en placas de ensayo multipocillo. La biotinilación de glóbulos rojos se ha utilizado como medio para determinar el volumen sanguíneo total sin el uso de radiomarcadores como el cromo 51, lo que permite determinaciones de volumen en bebés con bajo peso al nacer y mujeres embarazadas que de otro modo no podrían estar expuestos a las dosis requeridas de radiactividad. Además, la biotinilación de moléculas de MHC para crear multímeros de MHC se ha convertido en una herramienta útil para identificar y aislar poblaciones de células T específicas de antígeno. Más recientemente, se desarrolló la biotinilación de proteínas in vivo para estudiar las interacciones proteína-proteína y la proximidad en células vivas.

Determinación del grado de biotinilación

Las condiciones de reacción para la biotinilación se eligen de modo que la molécula objetivo (p. ej., un anticuerpo) esté marcada con suficientes moléculas de biotina para purificar o detectar la molécula, pero no tanto como para que la biotina interfiera con la función de la molécula.

Ensayo HABA

El ensayo HABA (ácido 2-(4-hidroxiazobenceno)benzoico) se puede utilizar para determinar el grado de biotinilación. El tinte HABA está unido a avidina o estreptavidina y produce una absorbancia característica. Cuando se introducen proteínas biotiniladas u otras moléculas, la biotina desplaza el tinte, lo que produce un cambio en la absorbancia a 500 nm. Este cambio es directamente proporcional al nivel de biotina en la muestra. La desventaja del ensayo HABA es que utiliza grandes cantidades de muestra.

Gel-shift de estreptavidina

El grado de biotinilación también se puede medir mediante el desplazamiento del gel de estreptavidina, ya que la estreptavidina permanece unida a la biotina durante la electroforesis en gel de agarosa o la electroforesis en gel de poliacrilamida. La proporción de diana biotinilada se puede medir mediante el cambio en la intensidad de la banda de la diana con o sin exceso de estreptavidina, observado de forma rápida y cuantitativa para las proteínas biotiniladas mediante tinción con azul brillante de Coomassie.