Beta-galactosidasa

β-galactosidasa (EC 3.2.1.23, lactasa, beta-gal o β-gal; nombre sistemático β-D-galactosido galactohidrolasa), es una enzima glucósido hidrolasa que cataliza la hidrólisis de residuos terminales no reductores de β-D-galactosa en β-D-galactósidos.

Los β-galactosidos incluyen carbohidratos que contienen galactosa donde el enlace glucosídico se encuentra por encima de la molécula de galactosa. Los sustratos de diferentes β-galactosidasas incluyen gangliósido GM1, lactosilceramidas, lactosa y varias glicoproteínas.

Función

La β-galactosidasa es una exoglucosidasa que hidroliza el enlace β-glucosídico formado entre una galactosa y su fracción orgánica. También puede escindir fucosidos y arabinosidos pero con una eficiencia mucho menor. Es una enzima esencial en el cuerpo humano. Las deficiencias en la proteína pueden provocar galactosialidosis o síndrome de Morquio B. En E. coli, el gen lacZ es el gen estructural de la β-galactosidasa; que está presente como parte del sistema inducible del operón lac que se activa en presencia de lactosa cuando el nivel de glucosa es bajo. La síntesis de β-galactosidasa se detiene cuando los niveles de glucosa son suficientes.

La β-galactosidasa tiene muchos homólogos basados en secuencias similares. Algunas son β-galactosidasa (EBG), β-glucosidasa, 6-fosfo-β-galactosidasa, β-manosidasa y lactasa-florizina hidrolasa. Aunque pueden ser estructuralmente similares, todos tienen funciones diferentes. Beta-gal es inhibido por L-ribosa, inhibidor no competitivo yodo e inhibidores competitivos 2-feniletilo 1-tio-β-D-galactopiranósido (PETG), D -galactonolactona, isopropil tio-β-D-galactósido (IPTG) y galactosa.

La β-galactosidasa es importante para los organismos, ya que es un proveedor clave en la producción de energía y una fuente de carbono a través de la descomposición de la lactosa en galactosa y glucosa. También es importante para la comunidad intolerante a la lactosa, ya que es responsable de producir leche y otros productos lácteos sin lactosa. Muchos humanos adultos carecen de la enzima lactasa, que tiene la misma función que la β-galactosidasa, por lo que no pueden digerir adecuadamente los productos lácteos. La β-galactosa se usa en productos lácteos como el yogur, la crema agria y algunos quesos que se tratan con la enzima para descomponer la lactosa antes del consumo humano. En los últimos años, la β-galactosidasa se ha investigado como un tratamiento potencial para la intolerancia a la lactosa a través de la terapia de reemplazo de genes en la que podría colocarse en el ADN humano para que las personas puedan descomponer la lactosa por sí mismas.

Estructura

Los 1.023 aminoácidos de E. coli β-galactosidasa se secuenciaron en 1983 y su estructura se determinó once años después, en 1994. La proteína es un homotetrámero de 464 kDa con simetría de 2,2,2 puntos. Cada unidad de β-galactosidasa consta de cinco dominios; el dominio 1 es un barril β tipo rollo de gelatina, los dominios 2 y 4 son barriles similares a fibronectina tipo III, el dominio 5 es un sándwich β novedoso, mientras que el dominio central 3 es un barril tipo TIM distorsionado, que carece de la quinta hélice con una distorsión en la sexta hebra.

El tercer dominio contiene el sitio activo. El sitio activo está formado por elementos de dos subunidades del tetrámero, y la disociación del tetrámero en dímeros elimina los elementos críticos del sitio activo. La secuencia amino-terminal de la β-galactosidasa, el péptido α involucrado en la complementación α, participa en una interfaz de subunidades. Sus residuos 22-31 ayudan a estabilizar un haz de cuatro hélices que forma la mayor parte de esa interfaz, y los residuos 13 y 15 también contribuyen a la activación de la interfaz. Estas características estructurales proporcionan una razón fundamental para el fenómeno de la complementación α, donde la eliminación del segmento amino-terminal da como resultado la formación de un dímero inactivo.

Reacción

β-galactosidasa reacción

La β-galactosidasa puede catalizar tres reacciones diferentes en los organismos. En uno, puede pasar por un proceso llamado transgalactosilación para producir alolactosa, creando un ciclo de retroalimentación positiva para la producción de β-galactosa. La alolactosa también se puede escindir para formar monosacáridos. También puede hidrolizar la lactosa en galactosa y glucosa que procederá a la glucólisis. El sitio activo de la β-galactosidasa cataliza la hidrólisis de su sustrato disacárido a través de la vía "superficial" (sitio improductivo) y "profundo" (sitio productivo) unión. Los galactósidos como PETG e IPTG se unirán en el sitio poco profundo cuando la enzima esté en estado 'abierto'. conformación mientras que los análogos del estado de transición como L-ribosa y D-galactonolactona se unirán en el sitio profundo cuando la conformación esté "cerrada".

La reacción enzimática consta de dos pasos químicos, galactosilación y degalactosilación. La galactosilación es el primer paso químico en la reacción en la que Glu461 dona un protón a un oxígeno glucosídico, lo que da como resultado que la galactosa se una covalentemente con Glu537. En el segundo paso, la degalactosilación, el enlace covalente se rompe cuando Glu461 acepta un protón, reemplazando la galactosa por agua. Dos estados de transición ocurren en el sitio profundo de la enzima durante la reacción, una vez después de cada paso. Cuando el agua participa en la reacción, se forma galactosa, de lo contrario, cuando la D-glucosa actúa como aceptor en el segundo paso, se produce la transgalactosilación. Se ha medido cinéticamente que los tetrámeros individuales de la proteína catalizan reacciones a una velocidad de 38.500 ± 900 reacciones por minuto. Los iones de potasio monovalentes (K⁺) así como los iones de magnesio divalentes (Mg²⁺) son necesarios para la actividad óptima de la enzima. El enlace β del sustrato se escinde por un grupo carboxilo terminal en la cadena lateral de un ácido glutámico.

La imagen de la izquierda es un diagrama de cinta de beta-galactosidase que muestra la ubicación de Glu 461, Glu 537 y Gly 794. La imagen de la derecha es un zoom en versión que muestra la interacción entre los aminoácidos.

En E. coli, se pensó que Glu-461 era el nucleófilo en la reacción de sustitución. Sin embargo, ahora se sabe que Glu-461 es un catalizador ácido. En cambio, Glu-537 es el nucleófilo real, que se une a un intermediario de galactosilo. En humanos, el nucleófilo de la reacción de hidrólisis es Glu-268. Gly794 es importante para la actividad de β-galactosidasa. Es responsable de poner la enzima en una conformación 'cerrada', unida al ligando, o 'abierta'. conformación, actuando como una "bisagra" para el bucle de sitio activo. Las diferentes conformaciones aseguran que solo se produzca una unión preferencial en el sitio activo. En presencia de un sustrato lento, la actividad de Gly794 aumentó, así como un aumento en la galactosilación y una disminución en la degalactosilación.

Aplicaciones

El ensayo de β-galactosidasa se usa con frecuencia en genética, biología molecular y otras ciencias de la vida. Se puede detectar una enzima activa utilizando sustrato cromogénico artificial 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido, X-gal. La β-galactosidasa dividirá el enlace glucosídico en X-gal y formará galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxiindol que se dimeriza y oxida a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro- índigo, un producto de color azul intenso, fácil de identificar y cuantificar. Se utiliza por ejemplo en pantalla blanca azul. Su producción puede ser inducida por un análogo no hidrolizable de alolactosa, IPTG, que se une y libera el represor lac del operador lac, lo que permite que prosiga el inicio de la transcripción.

Se usa comúnmente en biología molecular como marcador informador para controlar la expresión génica. También exhibe un fenómeno llamado complemento α que forma la base para la detección azul/blanca de clones recombinantes. Esta enzima se puede dividir en dos péptidos, LacZα y LacZΩ, ninguno de los cuales es activo por sí mismo, pero cuando ambos están presentes juntos, se vuelven a ensamblar espontáneamente en una enzima funcional. Esta propiedad se explota en muchos vectores de clonación donde la presencia del gen lacZα en un plásmido puede complementar en trans otro gen mutante que codifica el LacZΩ en cepas específicas de laboratorio de MI. coli. Sin embargo, cuando se insertan fragmentos de ADN en el vector, se interrumpe la producción de LacZα, por lo que las células no muestran actividad de β-galactosidasa. La presencia o ausencia de una β-galactosidasa activa puede detectarse mediante X-gal, que produce un tinte azul característico cuando se escinde con β-galactosidasa, proporcionando así un medio fácil de distinguir la presencia o ausencia de un producto clonado en un plásmido. En estudios de translocaciones cromosómicas de leucemia, Dobson y sus colegas utilizaron una proteína de fusión de LacZ en ratones, aprovechando la tendencia de la β-galactosidasa a oligomerizarse para sugerir un papel potencial de la oligomericidad en la función de la proteína de fusión MLL.

Una nueva isoforma de beta-galactosidasa con actividad óptima a pH 6,0 (beta-gal asociada a la senescencia o SA-beta-gal) que se expresa específicamente en la senescencia (la detención irreversible del crecimiento de las células). Incluso se desarrollaron ensayos cuantitativos específicos para su detección. Sin embargo, ahora se sabe que esto se debe a una sobreexpresión y acumulación de la beta-galactosidasa endógena lisosomal, y su expresión no es necesaria para la senescencia. Sin embargo, sigue siendo el biomarcador más utilizado para las células senescentes y envejecidas, porque es fiable y fácil de detectar.

Evolución

Algunas especies de bacterias, incluida E. coli, tienen genes adicionales de β-galactosidasa. Se descubrió un segundo gen, llamado gen evolucionado de β-galactosidasa (ebgA) cuando se eliminaron cepas con el gen lacZ (pero que aún contenían el gen de permeasa de galactósido, lacY ), se sembraron en medio que contenía lactosa (u otros 3-galactósidos) como única fuente de carbono. Después de un tiempo, ciertas colonias comenzaron a crecer. Sin embargo, la proteína EbgA es una lactasa ineficaz y no permite el crecimiento de la lactosa. Dos clases de mutaciones puntuales únicas mejoran drásticamente la actividad de la enzima ebg hacia la lactosa. y, como resultado, la enzima mutante puede reemplazar a la lacZ β-galactosidasa. EbgA y LacZ son 50% idénticos a nivel de ADN y 33% idénticos a nivel de aminoácidos. La enzima ebg activa es un agregado de productos del gen ebgA y del gen ebgC en una proporción de 1:1, siendo la forma activa de las enzimas ebg un heterooctámero α4 β4.

Distribución de especies

Gran parte del trabajo realizado sobre la β-galactosidasa se deriva de E. coli. Sin embargo, la enzima se puede encontrar en muchas plantas (especialmente frutas), mamíferos, levaduras, bacterias y hongos. Los genes de β-galactosidasa pueden diferir en la longitud de su secuencia de codificación y la longitud de las proteínas formadas por aminoácidos. Esto separa las β-galactosidasas en cuatro familias: GHF-1, GHF-2, GHF-35 y GHF-42. E. Coli pertenece a GHF-2, todas las plantas pertenecen a GHF-35 y Thermus thermophilus pertenece a GHF-42. Varias frutas pueden expresar múltiples genes de β-galactosidasa. Hay al menos 7 genes de β-galactosidasa expresados en el desarrollo de frutos de tomate, que tienen una similitud de aminoácidos entre 33% y 79%. Un estudio dirigido a identificar el ablandamiento de la fruta de los melocotones encontró 17 expresiones génicas diferentes de β-galactosidasas. La única otra estructura cristalina conocida de β-galactosidasa es de Thermus thermophilus.