Avidina
Avidina es una proteína tetramérica de unión a biotina producida en los oviductos de aves, reptiles y anfibios y depositada en la clara de sus huevos. En algunas bacterias también se encuentran miembros diméricos de la familia de la avidina. En la clara de huevo de gallina, la avidina constituye aproximadamente el 0,05% de la proteína total (aproximadamente 1800 μg por huevo). La proteína tetramérica contiene cuatro subunidades idénticas (homotetrámero), cada una de las cuales puede unirse a la biotina (vitamina B7, vitamina H) con un alto grado de afinidad y especificidad. La constante de disociación del complejo avidina-biotina se mide como KD ≈ 10−15 M, lo que lo convierte en uno de los no compuestos más fuertes conocidos. -enlaces covalentes.
En su forma tetramérica, se estima que la avidina tiene un tamaño de 66 a 69 kDa. El 10% del peso molecular lo aportan los carbohidratos, compuestos de cuatro a cinco residuos de manosa y tres N-acetilglucosamina. Los restos de carbohidratos de la avidina contienen al menos tres tipos estructurales de oligosacáridos únicos que son similares en estructura y composición.
La avidina funcional se encuentra en el huevo crudo, pero dependiendo de la cantidad de calor a la que se expone durante la cocción, la cantidad de moléculas disponibles para unir la biotina puede cambiar. Se desconoce la función natural de la avidina en los huevos, aunque se ha postulado que se produce en el oviducto como inhibidor del crecimiento bacteriano, al unirse a la biotina, lo que ayuda al crecimiento bacteriano. Como evidencia de esto, ciertas cepas de bacterias Streptomyces producen estreptavidina, una proteína relacionada con igual afinidad por la biotina y un sitio de unión muy similar, y se cree que sirve para inhibir el crecimiento de bacterias competidoras. a la manera de un antibiótico.
Se ha aislado una forma no glicosilada de avidina a partir de un producto preparado comercialmente; sin embargo, no es concluyente si la forma no glicosilada se produce de forma natural o es un producto del proceso de fabricación.
Descubrimiento
La avidina fue descubierta por Esmond Emerson Snell (1914–2003). Este descubrimiento comenzó con la observación de que los pollitos con una dieta de clara de huevo cruda tenían deficiencia de biotina, a pesar de la disponibilidad de la vitamina en su dieta. Se concluyó que un componente de la clara de huevo secuestraba biotina, lo que Snell verificó in vitro utilizando un ensayo de levadura. Posteriormente, Snell aisló el componente de la clara de huevo responsable de la unión de la biotina y, en colaboración con Paul György, confirmó que la proteína del huevo aislada era la causa de la deficiencia de biotina o "daño de la clara de huevo". En ese momento, investigadores de la Universidad de Texas habían llamado tentativamente a la proteína avidalbúmina (literalmente, albúmina hambrienta). Posteriormente, el nombre de la proteína se revisó a "avidina" en función de su afinidad por la biotina (ávido + biotina).
Aplicaciones
La investigación de la década de 1970 ayudó a establecer el sistema avidina-biotina como una poderosa herramienta en las ciencias biológicas. Conscientes de la fuerza y especificidad del complejo avidina-biotina, los investigadores comenzaron a explotar la avidina y la estreptavidina de pollo como sondas y matrices de afinidad en numerosos proyectos de investigación. Poco después, los investigadores Bayer y Wilchek desarrollaron nuevos métodos y reactivos para biotinilar anticuerpos y otras biomoléculas, lo que permitió la transferencia del sistema avidina-biotina a una variedad de aplicaciones biotecnológicas. Hoy en día, la avidina se utiliza en una variedad de aplicaciones que van desde investigación y diagnóstico hasta dispositivos médicos y productos farmacéuticos.
La afinidad de la avidina por la biotina se aprovecha en una amplia gama de ensayos bioquímicos, incluidos Western blot, ELISA, ELISPOT y ensayos pull-down. En algunos casos, el uso de anticuerpos biotinilados ha permitido la sustitución de anticuerpos marcados con yodo radiactivo en sistemas de radioinmunoensayo, para obtener un sistema de ensayo que no es radiactivo.
La avidina inmovilizada sobre soportes sólidos también se utiliza como medio de purificación para capturar moléculas de proteínas o ácidos nucleicos marcadas con biotina. Por ejemplo, las proteínas de la superficie celular pueden marcarse específicamente con un reactivo de biotina impermeable a la membrana y luego capturarse específicamente utilizando un soporte a base de avidina.
Formularios modificados
Como glicoproteína básicamente cargada, la avidina exhibe unión no específica en algunas aplicaciones. La avidina neutralita, una avidina desglicosilada con argininas modificadas, exhibe un punto isoeléctrico (pI) más neutro y está disponible como alternativa a la avidina nativa, siempre que surjan problemas de unión no específica. Las formas neutras desglicosiladas de avidina de pollo están disponibles a través de Sigma-Aldrich (Extravidin), Thermo Scientific (NeutrAvidin), Invitrogen (NeutrAvidin) y e-Proteins (NeutraLite).
Dada la fuerza del enlace avidina-biotina, la disociación del complejo avidina-biotina requiere condiciones extremas que causan la desnaturalización de las proteínas. La naturaleza no reversible del complejo avidina-biotina puede limitar la aplicación de la avidina en aplicaciones de cromatografía de afinidad donde es deseable la liberación del ligando capturado. Los investigadores han creado una avidina con características de unión reversible mediante nitración o yodación del sitio de unión tirosina. La avidina modificada exhibe fuertes características de unión a biotina a pH 4 y libera biotina a un pH de 10 o superior. También se emplea una forma monomérica de avidina con una afinidad reducida por la biotina en muchas resinas de afinidad disponibles comercialmente. La avidina monomérica se crea mediante el tratamiento de avidina nativa inmovilizada con urea o guanidina HCl (6–8 M), lo que le otorga una menor disociación KD ≈ 10− 7M. Esto permite que la elución de la matriz de avidina se produzca en condiciones más suaves y no desnaturalizantes, utilizando concentraciones bajas de biotina o condiciones de pH bajo. Para un único sitio de unión de biotina de alta afinidad sin reticulación, se puede usar una versión monovalente del pariente lejano de la avidina, la estreptavidina.
Bloqueo de la unión de biotina
La estabilidad térmica y la actividad de unión a biotina de la avidina son de interés tanto práctico como teórico para los investigadores, ya que la estabilidad de la avidina es inusualmente alta y la avidina es un antinutriente en la alimentación humana. Un estudio de 1966 publicado en Biochemical and Biophysical Research Communications encontró que la estructura de la avidina permanece estable a temperaturas inferiores a 70 °C (158 °F). Por encima de los 70 °C (158 °F), la estructura de la avidina se altera rápidamente y hacia los 85 °C (185 °F), se produce una gran pérdida de estructura y pérdida de la capacidad de unirse a la biotina. Un ensayo realizado en 1991 para el Journal of Food Science detectó una actividad sustancial de avidina en la clara de huevo cocida: "la actividad residual media de avidina en la clara de huevo frita, escalfada y hervida (2 min) fue 33, 71 y 40% de la actividad en clara de huevo cruda." El ensayo supuso que los tiempos de cocción no fueron suficientes para calentar adecuadamente todas las áreas frías dentro de la clara del huevo. La inactivación completa de la capacidad de unión a biotina de la avidina requirió hervir durante más de 4 minutos.
Un estudio de 1992 encontró que la inactivación térmica de la actividad de unión a biotina de la avidina se describió mediante D121 °C = 25 min yz = 33 °C. Este estudio no estuvo de acuerdo con suposiciones anteriores "de que el sitio de unión de la avidina se destruye con la desnaturalización por calor".
Las propiedades de unión a biotina de la avidina se aprovecharon durante el desarrollo de idrabiotaparinux, una heparina de bajo peso molecular de acción prolongada utilizada en el tratamiento de la trombosis venosa. Debido a la naturaleza de acción prolongada de idraparinux, surgieron preocupaciones sobre el tratamiento clínico de las complicaciones hemorrágicas. Al agregar una fracción de biotina a la molécula de idraparinux, se formó idrabiotaparinux; su actividad anticoagulante en el contexto de un episodio hemorrágico se puede revertir mediante una infusión intravenosa de avidina.