ARN polimerasa

En biología molecular, la ARN polimerasa (abreviada RNAP o RNApol), o más específicamente la ARN polimerasa dependiente/dirigida por ADN (DdRP), es una enzima que sintetiza ARN a partir de una plantilla de ADN.

Usando la enzima helicasa, RNAP abre localmente el ADN de doble cadena para que una cadena de los nucleótidos expuestos pueda usarse como plantilla para la síntesis de ARN, un proceso llamado transcripción. Un factor de transcripción y su complejo mediador de transcripción asociado deben unirse a un sitio de unión al ADN llamado región promotora antes de que RNAP pueda iniciar el desenrollado del ADN en esa posición. RNAP no solo inicia la transcripción de ARN, sino que también guía los nucleótidos a su posición, facilita la unión y la elongación, tiene capacidades intrínsecas de revisión y reemplazo, y capacidad de reconocimiento de terminación. En eucariotas, RNAP puede construir cadenas de hasta 2,4 millones de nucleótidos.

RNAP produce ARN que, funcionalmente, es para la codificación de proteínas, es decir, ARN mensajero (ARNm); o no codificantes (los llamados "genes de ARN"). Existen al menos cuatro tipos funcionales de genes de ARN:ARN de transferencia (ARNt)Transfiere aminoácidos específicos a cadenas polipeptídicas en crecimiento en el sitio ribosómico de síntesis de proteínas durante la traducción;ARN ribosómico (ARNr)Se incorpora a los ribosomas;Micro ARN (miARN)Regula la actividad de los genes; y,ARN catalítico (ribozima)Funciona como una molécula de ARN enzimáticamente activa.

La ARN polimerasa es esencial para la vida y se encuentra en todos los organismos vivos y en muchos virus. Dependiendo del organismo, una polimerasa de ARN puede ser un complejo proteico (RNAP de múltiples subunidades) o solo constar de una subunidad (RNAP de subunidad única, ssRNAP), cada una de las cuales representa un linaje independiente. El primero se encuentra en bacterias, arqueas y eucariotas por igual, y comparte una estructura central y un mecanismo similares. Este último se encuentra en fagos, así como en cloroplastos y mitocondrias eucariotas, y está relacionado con las ADN polimerasas modernas. Los RNAP eucarióticos y arqueales tienen más subunidades que los bacterianos y se controlan de manera diferente.

Las bacterias y las arqueas solo tienen una ARN polimerasa. Los eucariotas tienen múltiples tipos de RNAP nuclear, cada uno responsable de la síntesis de un subconjunto distinto de ARN:

1. La ARN polimerasa I sintetiza un pre-ARNr 45S (35S en la levadura), que madura y formará las principales secciones de ARN del ribosoma.
2. La ARN polimerasa II sintetiza precursores de ARNm y la mayoría de ARNs y microARN.
3. La ARN polimerasa III sintetiza ARNt, ARNr 5S y otros ARN pequeños que se encuentran en el núcleo y el citosol.
4. Las ARN polimerasas IV y V que se encuentran en las plantas son menos conocidas; hacen siRNA. Además de los ssRNAP, los cloroplastos también codifican y usan un RNAP similar a una bacteria.

Estructura

El Premio Nobel de Química de 2006 fue otorgado a Roger D. Kornberg por crear imágenes moleculares detalladas de la ARN polimerasa durante varias etapas del proceso de transcripción.

En la mayoría de los procariotas, una sola especie de ARN polimerasa transcribe todos los tipos de ARN. El "núcleo" de la ARN polimerasa de E. coli consta de cinco subunidades: dos subunidades alfa (α) de 36 kDa, una subunidad beta (β) de 150 kDa, una subunidad primaria beta (β′) de 155 kDa y una subunidad omega pequeña (ω) subunidad. Un factor sigma (σ) se une al núcleo y forma la holoenzima. Una vez que comienza la transcripción, el factor puede separarse y permitir que la enzima central continúe con su trabajo. El complejo central de ARN polimerasa forma una estructura de "garra de cangrejo" o "mandíbula de abrazadera" con un canal interno que se extiende a lo largo de toda su longitud. Las polimerasas de ARN eucariotas y arqueas tienen una estructura central similar y funcionan de manera similar, aunque tienen muchas subunidades adicionales.

Todos los RNAP contienen cofactores metálicos, en particular cationes de zinc y magnesio que ayudan en el proceso de transcripción.

Función

El control del proceso de transcripción génica afecta los patrones de expresión génica y, por lo tanto, permite que una célula se adapte a un entorno cambiante, realice funciones especializadas dentro de un organismo y mantenga los procesos metabólicos básicos necesarios para la supervivencia. Por lo tanto, no sorprende que la actividad de RNAP sea larga, compleja y altamente regulada. En la bacteria Escherichia coli se han identificado más de 100 factores de transcripción que modifican la actividad de RNAP.

RNAP puede iniciar la transcripción en secuencias de ADN específicas conocidas como promotores. Luego produce una cadena de ARN, que es complementaria a la hebra de ADN molde. El proceso de agregar nucleótidos a la cadena de ARN se conoce como elongación; en eucariotas, RNAP puede construir cadenas de hasta 2,4 millones de nucleótidos (la longitud total del gen de la distrofina). RNAP liberará preferentemente su transcrito de ARN en secuencias de ADN específicas codificadas al final de los genes, que se conocen como terminadores.

Los productos de RNAP incluyen:

• ARN mensajero (ARNm): plantilla para la síntesis de proteínas por parte de los ribosomas.
• ARN no codificante o "genes de ARN": una amplia clase de genes que codifican ARN que no se traduce en proteína. Los ejemplos más destacados de genes de ARN son el ARN de transferencia (ARNt) y el ARN ribosómico (ARNr), los cuales están involucrados en el proceso de traducción. Sin embargo, desde fines de la década de 1990, se han encontrado muchos genes de ARN nuevos y, por lo tanto, los genes de ARN pueden desempeñar un papel mucho más importante de lo que se pensaba anteriormente.
  • ARN de transferencia (ARNt): transfiere aminoácidos específicos a cadenas polipeptídicas en crecimiento en el sitio ribosomal de síntesis de proteínas durante la traducción
  • ARN ribosómico (ARNr): un componente de los ribosomas
  • Micro ARN: regula la actividad de los genes
  • ARN catalítico (ribozima): moléculas de ARN enzimáticamente activas

RNAP logra la síntesis de novo. Es capaz de hacer esto porque las interacciones específicas con el nucleótido iniciador mantienen RNAP rígidamente en su lugar, lo que facilita el ataque químico al nucleótido entrante. Tales interacciones específicas explican por qué RNAP prefiere comenzar las transcripciones con ATP (seguido de GTP, UTP y luego CTP). A diferencia de la ADN polimerasa, RNAP incluye actividad helicasa, por lo que no se necesita una enzima separada para desenrollar el ADN.

Acción

Iniciación

La unión de la ARN polimerasa en bacterias implica que el factor sigma reconozca la región promotora central que contiene los elementos -35 y -10 (ubicados antes del comienzo de la secuencia que se va a transcribir) y también, en algunos promotores, el promotor de reconocimiento del dominio C-terminal de la subunidad α aguas arriba elementos. Existen múltiples factores sigma intercambiables, cada uno de los cuales reconoce un conjunto distinto de promotores. Por ejemplo, en E. coli, σ se expresa en condiciones normales y reconoce los promotores de los genes necesarios en condiciones normales ("genes domésticos"), mientras que σreconoce promotores de genes requeridos a altas temperaturas ("genes de choque térmico"). En arqueas y eucariotas, las funciones del factor de transcripción general bacteriano sigma son realizadas por múltiples factores de transcripción generales que trabajan juntos. El complejo cerrado del promotor de la ARN polimerasa generalmente se denomina "complejo de preiniciación de la transcripción".

Después de unirse al ADN, la ARN polimerasa cambia de un complejo cerrado a un complejo abierto. Este cambio implica la separación de las hebras de ADN para formar una sección desenrollada de ADN de aproximadamente 13 pb, denominada "burbuja de transcripción". El superenrollamiento juega un papel importante en la actividad de la polimerasa debido al desenrollado y rebobinado del ADN. Debido a que las regiones de ADN frente a RNAP están desenrolladas, hay superenrollamientos positivos compensatorios. Las regiones detrás de RNAP están rebobinadas y hay superenrollamientos negativos.

Escape del promotor

Luego, la ARN polimerasa comienza a sintetizar el heterodúplex inicial de ADN-ARN, con ribonucleótidos apareados con la hebra de ADN molde de acuerdo con las interacciones de apareamiento de bases de Watson-Crick. Como se señaló anteriormente, la ARN polimerasa hace contacto con la región promotora. Sin embargo, estos contactos estabilizadores inhiben la capacidad de la enzima para acceder al ADN aguas abajo y, por lo tanto, la síntesis del producto de longitud completa. Para continuar con la síntesis de ARN, la ARN polimerasa debe escapar del promotor. Debe mantener los contactos del promotor mientras desenrolla más ADN aguas abajo para la síntesis, "aplastando" más ADN aguas abajo en el complejo de iniciación.Durante la transición de escape del promotor, la ARN polimerasa se considera un "intermedio estresado". Termodinámicamente, el estrés se acumula a partir de las actividades de desenrollado y compactación del ADN. Una vez que el heterodúplex de ADN-ARN es lo suficientemente largo (~10 pb), la ARN polimerasa libera sus contactos aguas arriba y logra efectivamente la transición de escape del promotor a la fase de elongación. El heterodúplex en el centro activo estabiliza el complejo de elongación.

Sin embargo, el escape del promotor no es el único resultado. La ARN polimerasa también puede aliviar el estrés liberando sus contactos aguas abajo, deteniendo la transcripción. El complejo de transcripción en pausa tiene dos opciones: (1) liberar la transcripción naciente y comenzar de nuevo en el promotor o (2) restablecer un nuevo 3'-OH en la transcripción naciente en el sitio activo a través de la actividad catalítica de la ARN polimerasa y reiniciar la trituración del ADN para lograr el escape del promotor. La iniciación abortiva, el ciclo improductivo de la ARN polimerasa antes de la transición de escape del promotor, da como resultado fragmentos cortos de ARN de alrededor de 9 pb en un proceso conocido como transcripción abortiva. La extensión de la iniciación abortiva depende de la presencia de factores de transcripción y la fuerza de los contactos del promotor.

Alargamiento

El complejo transcripcional de 17 pb tiene un híbrido de ADN-ARN de 8 pb, es decir, 8 pares de bases involucran el transcrito de ARN unido a la hebra molde de ADN. A medida que avanza la transcripción, se agregan ribonucleótidos al extremo 3 'de la transcripción de ARN y el complejo RNAP se mueve a lo largo del ADN. Las tasas de elongación características en procariotas y eucariotas son de aproximadamente 10 a 100 nts/seg.

Los residuos de aspartil (asp) en el RNAP se aferrarán a los iones Mg, que, a su vez, coordinarán los fosfatos de los ribonucleótidos. El primer Mg retendrá el α-fosfato del NTP que se agregará. Esto permite el ataque nucleofílico del 3′-OH del transcrito de ARN, agregando otro NTP a la cadena. El segundo Mg se aferrará al pirofosfato del NTP. La ecuación de reacción general es:(NMP) _n + NTP → (NMP) _{n + 1} + PP _i

Fidelidad

A diferencia de los mecanismos de corrección de pruebas de la ADN polimerasa, los de RNAP se han investigado recientemente. La revisión comienza con la separación del nucleótido mal incorporado de la plantilla de ADN. Esto detiene la transcripción. Luego, la polimerasa retrocede una posición y escinde el dinucleótido que contiene el nucleótido que no coincide. En la ARN polimerasa, esto ocurre en el mismo sitio activo utilizado para la polimerización y, por lo tanto, es marcadamente diferente de la ADN polimerasa, donde la corrección de pruebas ocurre en un sitio activo de nucleasa distinto.

La tasa de error general es de alrededor de 10 a 10.

Terminación

En las bacterias, la terminación de la transcripción del ARN puede ser dependiente o independiente de rho. El primero se basa en el factor rho, que desestabiliza el heterodúplex ADN-ARN y provoca la liberación de ARN. Este último, también conocido como terminación intrínseca, se basa en una región palindrómica de ADN. La transcripción de la región provoca la formación de una estructura de "horquilla" a partir del bucle de transcripción del ARN y la unión sobre sí mismo. Esta estructura de horquilla suele ser rica en pares de bases GC, lo que la hace más estable que el propio híbrido ADN-ARN. Como resultado, el híbrido ADN-ARN de 8 pb en el complejo de transcripción cambia a un híbrido de 4 pb. Estos últimos 4 pares de bases son pares de bases AU débiles y todo el transcrito de ARN se desprenderá del ADN.

La terminación de la transcripción en eucariotas se comprende menos que en bacterias, pero implica la escisión de la nueva transcripción seguida de la adición de adeninas independiente de la plantilla en su nuevo extremo 3 ', en un proceso llamado poliadenilación.

Otros organismos

Dado que las polimerasas de ADN y ARN llevan a cabo una polimerización de nucleótidos dependiente de la plantilla, se podría esperar que los dos tipos de enzimas estuvieran relacionados estructuralmente. Sin embargo, los estudios cristalográficos de rayos X de ambos tipos de enzimas revelan que, además de contener un ion Mg crítico en el sitio catalítico, prácticamente no tienen relación entre sí; de hecho, las enzimas de polimerización de nucleótidos dependientes de la plantilla parecen haber surgido de forma independiente dos veces durante la evolución temprana de las células. Un linaje condujo a las ADN polimerasas y transcriptasas inversas modernas, así como a algunas ARN polimerasas de una sola subunidad (ssRNAP) de fagos y orgánulos. El otro linaje RNAP de subunidades múltiples formó todas las polimerasas de ARN celulares modernas.

Bacterias

En bacterias, la misma enzima cataliza la síntesis de ARNm y ARN no codificante (ncRNA).

RNAP es una molécula grande. La enzima central tiene cinco subunidades (~ 400 kDa):β′La subunidad β′ es la subunidad más grande y está codificada por el gen rpoC. La subunidad β' contiene parte del centro activo responsable de la síntesis de ARN y contiene algunos de los determinantes de las interacciones no específicas de secuencia con el ADN y el ARN naciente. Se divide en dos subunidades en cianobacterias y cloroplastos.bLa subunidad β es la segunda subunidad más grande y está codificada por el gen rpoB. La subunidad β contiene el resto del centro activo responsable de la síntesis de ARN y contiene el resto de los determinantes de las interacciones no específicas de secuencia con el ADN y el ARN naciente.α (α y α )Dos copias de la subunidad α, que es la tercera subunidad más grande, están presentes en una molécula de RNAP: α y α (uno y dos). Cada subunidad α contiene dos dominios: αNTD (dominio N-terminal) y αCTD (dominio C-terminal). αNTD contiene determinantes para el ensamblaje de RNAP. αCTD (dominio C-terminal) contiene determinantes para la interacción con el ADN del promotor, lo que genera interacciones no específicas de secuencia en la mayoría de los promotores e interacciones específicas de secuencia en los promotores que contienen elementos aguas arriba, y contiene determinantes para interacciones con factores reguladores.ωLa subunidad ω es la subunidad más pequeña. La subunidad ω facilita el ensamblaje de RNAP y estabiliza el RNAP ensamblado.

Para unirse a los promotores, el núcleo de RNAP se asocia con el factor de iniciación de la transcripción sigma (σ) para formar una holoenzima de ARN polimerasa. Sigma reduce la afinidad de RNAP por el ADN no específico mientras aumenta la especificidad por los promotores, lo que permite que la transcripción se inicie en los sitios correctos. Por lo tanto, la holoenzima completa tiene 6 subunidades: β′βα y α ωσ (~ 450 kDa).

Eucariotas

Los eucariotas tienen múltiples tipos de RNAP nuclear, cada uno responsable de la síntesis de un subconjunto distinto de ARN. Todos están relacionados estructural y mecánicamente entre sí y con el RNAP bacteriano:

1. La ARN polimerasa I sintetiza un pre-ARNr 45S (35S en levadura), que madura en ARNr 28S, 18S y 5.8S, que formarán las principales secciones de ARN del ribosoma.
2. La ARN polimerasa II sintetiza precursores de ARNm y la mayoría de ARNsn y microARN. Este es el tipo más estudiado y, debido al alto nivel de control requerido sobre la transcripción, se requiere una variedad de factores de transcripción para su unión a los promotores.
3. La ARN polimerasa III sintetiza ARNt, ARNr 5S y otros ARN pequeños que se encuentran en el núcleo y el citosol.
4. La ARN polimerasa IV sintetiza ARNsi en plantas.
5. La ARN polimerasa V sintetiza ARN implicados en la formación de heterocromatina dirigida por ARNsi en plantas.

Los cloroplastos eucarióticos contienen un RNAP muy similar al RNAP bacteriano ("polimerasa codificada por plastidios, PEP"). Utilizan factores sigma codificados en el genoma nuclear.

Los cloroplastos también contienen una segunda RNAP de una sola subunidad, estructural y mecánicamente no relacionada ("polimerasa codificada por núcleo, NEP"). Las mitocondrias eucarióticas utilizan POLRMT (humano), un RNAP de una sola subunidad codificado en el núcleo. Tales polimerasas similares a fagos se denominan RpoT en plantas.

Arqueas

Archaea tiene un solo tipo de RNAP, responsable de la síntesis de todo el ARN. Archaeal RNAP es estructural y mecánicamente similar al RNAP bacteriano y al RNAP nuclear eucariota IV, y está especialmente relacionado estructural y mecánicamente con el RNAP nuclear eucariota II. La historia del descubrimiento de la polimerasa de ARN arqueal es bastante reciente. El primer análisis del RNAP de un archaeon se realizó en 1971, cuando se aisló y purificó el RNAP del halófilo extremo Halobacterium cutirubrum. Las estructuras cristalinas de RNAP de Sulfolobus solfataricus y Sulfolobus shibatae establecen el número total de subunidades arqueales identificadas en trece.

Archaea tiene la subunidad correspondiente a Eukaryotic Rpb1 dividida en dos. No existe un homólogo para el Rpb9 eucariótico (POLR2I) en el complejo S. shibatae, aunque se ha propuesto el TFS (homólogo de TFIIS) como uno basado en la similitud. Hay una subunidad adicional denominada Rpo13; junto con Rpo5, ocupa un espacio ocupado por una inserción que se encuentra en las subunidades β 'bacterianas (1377–1420 en Taq ). Un estudio anterior de menor resolución sobre la estructura de S. solfataricus no encontró Rpo13 y solo asignó el espacio a Rpo5/Rpb5. Rpo3 es notable porque es una proteína de hierro y azufre. La subunidad AC40 de RNAP I/III que se encuentra en algunos eucariotas comparte secuencias similares, pero no se une al hierro. Este dominio, en cualquier caso, cumple una función estructural.

La subunidad Archaeal RNAP usaba anteriormente una nomenclatura "RpoX" en la que a cada subunidad se le asigna una letra de una manera que no está relacionada con ningún otro sistema. En 2009, se propuso una nueva nomenclatura basada en la numeración de la subunidad "Rpb" de Eukaryotic Pol II.

Virus

Los ortopoxvirus y algunos otros virus de ADN grande nucleocitoplasmático sintetizan ARN utilizando un RNAP de múltiples subunidades codificado viralmente. Son más similares a los RNAP eucariotas, con algunas subunidades minimizadas o eliminadas. Exactamente a qué RNAP son más similares es un tema de debate. La mayoría de los otros virus que sintetizan ARN utilizan mecanismos no relacionados.

Muchos virus utilizan un RNAP dependiente de ADN de una sola subunidad (ssRNAP) que está estructural y mecánicamente relacionado con el RNAP de una sola subunidad de los cloroplastos eucariotas (RpoT) y las mitocondrias (POLRMT) y, más distantemente, con las ADN polimerasas y las transcriptasas inversas. Quizás el RNAP de una sola subunidad más estudiado es la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Los ssRNAP no pueden corregir.

El profago SPβ de B. subtilis usa YonO, un homólogo de las subunidades β+β′ de los msRNAP para formar un RNAP monomérico (ambos barriles en la misma cadena) distinto del ssRNAP habitual de la "mano derecha". Probablemente divergió hace mucho tiempo del msRNAP canónico de cinco unidades, antes de la época del último ancestro común universal.

Otros virus usan un RNAP dependiente de ARN (un RNAP que emplea ARN como plantilla en lugar de ADN). Esto ocurre en virus de ARN de hebra negativa y virus de ARNbc, los cuales existen durante una parte de su ciclo de vida como ARN de doble hebra. Sin embargo, algunos virus de ARN de cadena positiva, como el poliovirus, también contienen RNAP dependiente de ARN.

Historia

RNAP fue descubierto de forma independiente por Charles Loe, Audrey Stevens y Jerard Hurwitz en 1960. En ese momento, la mitad del Premio Nobel de Medicina de 1959 había sido otorgado a Severo Ochoa por el descubrimiento de lo que se creía que era RNAP, pero en cambio se convirtió en resulta ser polinucleótido fosforilasa.

Purificación

La ARN polimerasa se puede aislar de las siguientes maneras:

• Por una columna de fosfocelulosa.
• Por centrifugación en gradiente de glicerol.
• Por una columna de ADN.
• Por una columna de cromatografía iónica.

Y también combinaciones de las técnicas anteriores.