Análisis del flujo metabólico

El análisis de flujo metabólico (MFA) es una técnica fluxómica experimental que se utiliza para examinar las tasas de producción y consumo de metabolitos en un sistema biológico. A nivel intracelular, permite la cuantificación de los flujos metabólicos, lo que permite dilucidar el metabolismo central de la célula. Varios métodos de MFA, incluidos el análisis de flujo metabólico isotópicamente estacionario, el análisis de flujo metabólico isotópicamente no estacionario y el análisis de flujo metabólico basado en la termodinámica, se pueden combinar con modelos estequiométricos de metabolismo y métodos de espectrometría de masas con resolución de masa isotópica para dilucidar la transferencia de fracciones que contienen trazadores isotópicos de un metabolito a otro y derivar información sobre la red metabólica. El análisis de flujo metabólico (MFA) tiene muchas aplicaciones, como determinar los límites de la capacidad de un sistema biológico para producir un bioquímico como el etanol, predecir la respuesta a la inactivación de genes y guiar la identificación de enzimas que constituyen cuellos de botella en las redes metabólicas para los esfuerzos de ingeniería metabólica.

El análisis de flujo metabólico puede utilizar trazadores de isótopos marcados con 13C para experimentos de marcado isotópico. Las técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) y la espectrometría de masas pueden utilizarse para medir los patrones de marcado de metabolitos y proporcionar información para la determinación de los flujos de las vías metabólicas. Debido a que el análisis de flujo metabólico generalmente requiere un cálculo riguroso del flujo de redes metabólicas complejas, se han desarrollado herramientas de software disponibles públicamente para automatizar el análisis de flujo metabólico y reducir su carga computacional.

Aunque el uso de un equilibrio estequiométrico y de restricciones de los metabolitos que componen la red metabólica puede dilucidar los flujos, este enfoque tiene limitaciones, incluida la dificultad de estimular los flujos a través de vías paralelas, cíclicas y reversibles. Además, existe un conocimiento limitado sobre cómo los metabolitos se interconvierten en una red metabólica sin el uso de trazadores isotópicos. Por lo tanto, el uso de isótopos se ha convertido en la técnica dominante para la MFA.

Los experimentos de etiquetado isotópico son óptimos para recopilar datos experimentales necesarios para la MFA. Debido a que los flujos determinan los patrones de etiquetado isotópico de los metabolitos intracelulares, la medición de estos patrones permite la inferencia de flujos. El primer paso en el flujo de trabajo de los experimentos de etiquetado isotópico es el cultivo celular en sustratos etiquetados. Un sustrato como la glucosa se etiqueta con isótopos, generalmente ¹³C, y se introduce en el medio de cultivo. El medio también contiene típicamente vitaminas y aminoácidos esenciales para facilitar el crecimiento celular. Luego, las células metabolizan el sustrato etiquetado, lo que lleva a la incorporación del trazador ¹³C en otros metabolitos intracelulares. Una vez que las células alcanzan una fisiología de estado estable (es decir, concentraciones constantes de metabolitos en el cultivo), las células se lisan para extraer metabolitos. En el caso de las células de mamíferos, la extracción implica la extinción de las células con metanol para detener su metabolismo celular y la posterior extracción de metabolitos con metanol y agua. Las concentraciones de metabolitos y de isótopos marcados en los metabolitos de los extractos se miden mediante instrumentos como la cromatografía líquida-espectrometría de masas o RMN, que también proporcionan información sobre la posición y el número de átomos marcados en los metabolitos. Estos datos son necesarios para obtener información sobre la dinámica del metabolismo intracelular y las tasas de recambio de metabolitos para inferir el flujo metabólico.

Un método predominante para el análisis de flujo metabólico es el MFA isotópicamente estacionario. Esta técnica para la cuantificación de flujo es aplicable en estado estacionario metabólico e isotópico, dos condiciones que suponen que las concentraciones de metabolitos y las distribuciones de isotopómeros no cambian con el tiempo, respectivamente. El conocimiento de la matriz estequiométrica (S) que comprende el consumo y la producción de metabolitos dentro de las reacciones bioquímicas es necesario para equilibrar los flujos (v) en torno al modelo de red metabólica asumido. Suponiendo un estado estacionario metabólico, los flujos metabólicos pueden cuantificarse resolviendo la inversa de la siguiente ecuación de álgebra lineal simple:

${\displaystyle S\times v=0}$

Para reducir el espacio de solución posible para las distribuciones de flujo, el MFA isotópicamente estacionario requiere restricciones estequiométricas adicionales, como tasas de crecimiento, secreción y absorción de sustrato y tasas de acumulación de producto, así como límites superiores e inferiores para los flujos. Aunque el MFA isotópicamente estacionario permite una deducción precisa de los flujos metabólicos mediante modelos matemáticos, el análisis se limita a cultivos por lotes durante la fase exponencial. Además, después de la adición de un sustrato marcado, puede resultar difícil determinar el momento en el que se puede suponer con precisión el estado estacionario metabólico e isotópico.

Cuando el etiquetado isotópico es transitorio y aún no se ha equilibrado, el método MFA isotópicamente no estacionario (INST-MFA) resulta ventajoso para deducir flujos, en particular para sistemas con dinámicas de etiquetado lentas. De manera similar al método MFA isotópicamente estacionario, este método requiere balances de masa e isotopómeros para caracterizar la estequiometría y las transiciones atómicas de la red metabólica. Sin embargo, a diferencia de los métodos MFA tradicionales, el método INST-MFA requiere la aplicación de ecuaciones diferenciales ordinarias para examinar cómo cambian con el tiempo los patrones de etiquetado isotópico de los metabolitos; dicho examen se puede lograr midiendo los patrones de etiquetado isotópico cambiantes en diferentes puntos de tiempo para ingresarlos en el método INST-MFA. Por lo tanto, el método INST-MFA es un método poderoso para dilucidar los flujos de sistemas con cuellos de botella en las vías y revelar fenotipos metabólicos de organismos autótrofos. Si bien las demandas computacionales intensivas de INST-MFA anteriormente obstaculizaban su uso generalizado, las herramientas de software desarrolladas recientemente han simplificado INST-MFA para reducir el tiempo computacional y la demanda.

El análisis de flujo metabólico basado en la termodinámica (TMFA) es un tipo especializado de análisis de flujo metabólico que utiliza restricciones termodinámicas lineales además de restricciones de balance de masa para generar flujos termodinámicamente factibles y perfiles de actividad de metabolitos. El TMFA solo tiene en cuenta las vías y los flujos que son factibles mediante el uso del cambio de energía libre de Gibbs de las reacciones y actividades de los metabolitos que forman parte del modelo. Al calcular las energías libres de Gibbs de las reacciones metabólicas y, en consecuencia, su favorabilidad termodinámica, el TMFA facilita la identificación de reacciones limitantes de cuellos de botella de las vías que pueden ser candidatos ideales para la regulación de las vías.

Se necesitan algoritmos de simulación para modelar el sistema biológico y calcular los flujos de todas las vías en una red compleja. Existen varios programas informáticos para satisfacer la necesidad de herramientas eficientes y precisas para la cuantificación de flujos. En general, los pasos para aplicar software de modelado a la MFA incluyen la reconstrucción metabólica para compilar todas las reacciones enzimáticas y metabolitos deseados, proporcionar información experimental como el patrón de etiquetado del sustrato, definir restricciones como ecuaciones de crecimiento y minimizar el error entre los resultados experimentales y simulados para obtener flujos finales. Algunos ejemplos de software de MFA incluyen 13CFLUX2 y OpenFLUX, que evalúan experimentos de etiquetado de ¹³C para el cálculo de flujos en condiciones metabólicas e isotópicamente estacionarias. El creciente interés en el desarrollo de herramientas informáticas para el cálculo de INST-MFA también ha llevado al desarrollo de aplicaciones de software como INCA, que fue el primer software capaz de realizar INST-MFA y simular experimentos de etiquetado de isótopos transitorios.

El análisis de flujo metabólico se ha utilizado para orientar los esfuerzos de ampliación de la fermentación de biocombustibles. Al medir directamente las tasas de reacción enzimática, el análisis de flujo metabólico puede capturar la dinámica del comportamiento de las células y los fenotipos metabólicos en biorreactores durante fermentaciones a gran escala. Por ejemplo, los modelos de análisis de flujo metabólico se utilizaron para optimizar la conversión de xilosa en etanol en levaduras fermentadoras de xilosa mediante el uso de distribuciones de flujo calculadas para determinar las capacidades teóricas máximas de la levadura seleccionada para la producción de etanol.

La identificación de las enzimas que actúan como cuello de botella determina las reacciones que limitan la velocidad y que limitan la productividad de una vía biosintética. Además, el análisis de la modulación de la enzima puede ayudar a predecir fenotipos inesperados de cepas modificadas genéticamente al generar una comprensión fundamental de cómo se conectan los flujos en las células modificadas. Por ejemplo, al calcular las energías libres de Gibbs de las reacciones en el metabolismo de Escherichia coli, el análisis de la modulación de la enzima facilitó la identificación de una reacción termodinámica que actúa como cuello de botella en un modelo a escala del genoma de Escherichia coli.

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