Amplificación isotérmica mediada por bucle

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Proceso de amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP)
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una técnica de un solo tubo para la amplificación de ADN con fines diagnósticos y una alternativa económica para detectar ciertas enfermedades. LAMP es una técnica de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. A diferencia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en la que la reacción se lleva a cabo mediante una serie de pasos o ciclos de temperatura alterna, la amplificación isotérmica se realiza a temperatura constante y no requiere un termociclador. La LAMP fue inventada en 1998 por Eiken Chemical Company en Tokio. La amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) combina la LAMP con un paso de transcripción inversa para permitir la detección de ARN.

Amplificación

Imprimaciones de amplificación isotérmica mediada por lazo (LAMP)
Producto de amplificación isotérmica mediada por loop (LAMP)
En LAMP, la secuencia diana se amplifica a una temperatura constante de 60-65 °C (140-149 °F) utilizando dos o tres conjuntos de cebadores y un fragmento Bst Klenow similar a la polimerasa con alta actividad de desplazamiento de cadena, además de actividad de replicación. Normalmente, se utilizan cuatro cebadores diferentes para amplificar seis regiones distintas del gen diana, lo que aumenta la especificidad. Un par adicional de cebadores de bucle puede acelerar aún más la reacción. La cantidad de ADN producida en LAMP es considerablemente mayor que la amplificación basada en PCR. El diseño de cebadores puede realizarse con varios programas, como PrimerExplorer, MorphoCatcher y NEB LAMP Primer Design Tool. Para el cribado de polimorfismos de nucleótidos conservadores y específicos de especie, en la mayoría de las aplicaciones de diagnóstico, la combinación de PrimerExplorer y MorphoCatcher resulta muy útil, ya que permite la localización de nucleótidos específicos de especie en los extremos 3' de los cebadores para mejorar la especificidad de las reacciones.

Schema of a LAMP of nucleic acid biomarkers from raw untreated wastewater samples, to quickly quantify human-specific mitocondrial DNA (mtDNA).

Detección

El producto de amplificación puede detectarse mediante fotometría, midiendo la turbidez causada por el precipitado de pirofosfato de magnesio en solución como subproducto de la amplificación. Esto permite una fácil visualización a simple vista o mediante métodos fotométricos sencillos para volúmenes pequeños. La reacción puede seguirse en tiempo real midiendo la turbidez o mediante fluorescencia con colorantes intercalantes como SYTO 9.Los colorantes, como el verde SYBR, pueden utilizarse para crear un cambio de color visible a simple vista sin necesidad de equipos costosos, o para obtener una respuesta que pueda medirse con mayor precisión mediante instrumentación. Las moléculas de colorante se intercalan o marcan directamente el ADN y, a su vez, pueden correlacionarse con el número de copias presentes inicialmente. Por lo tanto, LAMP también puede ser cuantitativa. La detección en tubo de la amplificación de ADN LAMP es posible utilizando calceína cargada con manganeso, que comienza a fluorescer tras la complejación del manganeso con pirofosfato durante la síntesis de ADN in vitro. Otro método para la detección visual de los amplicones LAMP a simple vista se basó en su capacidad para hibridar con ADN monocatenario (ssDNA) complementario unido a nanopartículas de oro (AuNP), evitando así el cambio de color normal de rojo a azul púrpura que se produciría durante la agregación de las partículas de oro inducida por la sal. Por lo tanto, un método LAMP combinado con la detección de amplicones mediante AuNP puede tener ventajas sobre otros métodos en términos de reducción del tiempo de ensayo, confirmación de amplicones mediante hibridación y uso de equipos más sencillos (es decir, sin necesidad de termociclador, equipo de electroforesis ni transiluminador UV).
Detección colorimétrica
Los indicadores de colorante dependientes del pH, como el rojo fenol, inducen un cambio de color de rosa a amarillo cuando el valor de pH de la reacción disminuye tras la amplificación del ADN. Debido a su pronunciado cambio de color, esta es la lectura más utilizada para los ensayos RT-LAMP. Sin embargo, la lectura dependiente del cambio de pH requiere una solución de reacción poco tamponada, lo que supone un gran reto al utilizar muestras crudas con pH variable. Un segundo ensayo colorimétrico utiliza indicadores de iones metálicos como el azul de hidroxinaftol (HNB), que cambia de color de púrpura a azul al disminuir la cantidad de iones Mg2+ libres, que forman un precipitado de pirofosfato de Mg tras la amplificación del ADN.

Usos y beneficios

LAMP es una técnica de amplificación de ADN relativamente nueva que, gracias a su simplicidad, robustez y bajo coste, podría ofrecer importantes ventajas. LAMP tiene el potencial de ser utilizada como un ensayo de cribado sencillo tanto sobre el terreno como en el punto de atención por los médicos. Dado que LAMP es isotérmico, lo que elimina la necesidad de los costosos termocicladores que se utilizan en la PCR convencional, puede ser un método particularmente útil para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en países de ingresos bajos y medios. LAMP se está estudiando ampliamente para detectar enfermedades infecciosas como la filariasis, el virus del Zika, la tuberculosis, la malaria, la enfermedad del sueño y el SARS-CoV-2. En las regiones en desarrollo, aún no se ha validado exhaustivamente para otros patógenos comunes.Se ha observado que LAMP es menos sensible (más resistente) que la PCR a los inhibidores en muestras complejas como la sangre, probablemente debido al uso de una ADN polimerasa diferente (típicamente, la ADN polimerasa Bst – Bacillus stearothermophilus, en lugar de la Taq polimerasa, como en la PCR). Varios informes describen la detección exitosa de patógenos en muestras mínimamente procesadas, como sangre tratada térmicamente, o en presencia de matrices de muestras clínicas. Esta característica de LAMP puede ser útil en entornos de bajos recursos o de campo, donde la extracción convencional de ADN o ARN antes de las pruebas diagnósticas puede resultar poco práctica.LAMP también se ha utilizado para identificar fluidos corporales. Gracias a su simplicidad, los investigadores pueden analizar una o más muestras con poca intervención, lo que reduce el tiempo necesario para obtener resultados. Además, se han añadido factores para simplificar aún más la identificación, como el tinte indicador metálico y el rojo fenol, para poder analizar los resultados a simple vista y con un teléfono inteligente, respectivamente.

Limitaciones

LAMP es menos versátil que la PCR, la técnica de amplificación de ácidos nucleicos más consolidada. LAMP es útil principalmente como técnica de diagnóstico o detección, pero no para la clonación ni para muchas otras aplicaciones de biología molecular que permite la PCR. Dado que LAMP utiliza 4 (o 6) cebadores que se dirigen a 6 (u 8) regiones dentro de un segmento relativamente pequeño del genoma, y dado que el diseño de cebadores está sujeto a numerosas restricciones, resulta difícil diseñar conjuntos de cebadores para LAMP "a ojo". Generalmente, se utilizan paquetes de software gratuitos, de código abierto o comerciales para facilitar el diseño de cebadores LAMP, aunque las limitaciones en el diseño de cebadores implican menos libertad para elegir el sitio diana que con la PCR.En una aplicación diagnóstica, esto debe sopesarse con la necesidad de elegir una diana adecuada (p. ej., un sitio conservado en un genoma viral altamente variable o una diana específica para una cepa particular de patógeno). Pueden requerirse múltiples secuencias degeneradas para cubrir las diferentes cepas variantes de la misma especie. Una consecuencia de tener tal combinación de cebadores puede ser una amplificación inespecífica en la fase final de la amplificación.Los métodos de multiplexación para LAMP están menos desarrollados que para PCR. El mayor número de cebadores por diana en LAMP aumenta la probabilidad de interacciones cebador-cebador para conjuntos de dianas multiplexadas. El producto de LAMP es una serie de concatémeros de la región diana, lo que da lugar a un patrón característico de "escalera" o de bandas en un gel, en lugar de una sola banda como en la PCR. Si bien esto no supone un problema al detectar dianas individuales con LAMP, las aplicaciones de PCR multiplex "tradicionales" (de punto final), en las que la identidad de una diana se confirma mediante el tamaño de una banda en un gel, no son viables con LAMP. La multiplexación en LAMP se ha logrado seleccionando una región diana con un sitio de restricción y digiriéndola antes de procesarla en un gel, de modo que cada producto dé lugar a un tamaño de fragmento distinto, aunque este enfoque añade complejidad al diseño y al protocolo experimental.El uso de una ADN polimerasa con desplazamiento de cadena en LAMP también excluye el uso de sondas de hidrólisis, como las sondas TaqMan, que dependen de la actividad exonucleasa 5'-3' de la Taq polimerasa. Se ha descrito un enfoque alternativo de multiplexación en tiempo real basado en supresores de fluorescencia.Se puede añadir el colorante verde SYBR para visualizar LAMP en tiempo real. Sin embargo, en la fase tardía de la amplificación, la amplificación del dímero del cebador puede contribuir a una señal de falso positivo. El uso de pirofosfatasa inorgánica en una mezcla de reacción SYBR permite el análisis de fusión para determinar si la amplificación es correcta.Si bien se han propuesto diferentes estrategias de mitigación para los resultados falsos positivos en ensayos basados en este método, la amplificación inespecífica debida a diversos factores, incluida la ausencia de mecanismos de regulación de la temperatura, es una de las principales limitaciones de la amplificación isotérmica mediada por bucle.Por último, dado que LAMP requiere temperaturas de incubación elevadas y mantenidas (60-65 °C), se requiere algún tipo de mecanismo de calentamiento, termostato o aislante (aunque no necesariamente un termociclador). Este requisito hace que LAMP sea menos adecuado para el diagnóstico en el punto de atención, que idealmente funcionaría a temperatura ambiente.

Research

La amplificación asistida por hibridación de ARNasa (RHAM) integra LAMP con la señalización fluorescente mediada por la ARNasa HII. Este método emplea un conjunto de cebadores LAMP convencionales para amplificar exponencialmente la secuencia diana, seguido de la hibridación de una sonda fluorescente que contiene ribonucleótidos con el producto de amplificación. La ARNasa HII escinde la sonda, liberando una señal fluorescente detectable.

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